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來源：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》2022年第15期

作者：關(guān)若冰1,2,李海超1,2,苗雪霞2*(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院；2.中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心昆蟲發(fā)育與進(jìn)化生物學(xué)重點實驗室)

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01  

RNA干擾技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展

RNA干擾(RNA interference,RNAi)機制自1998年發(fā)現(xiàn)以來,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因功能、生物醫(yī)藥以及農(nóng)作物病蟲害防控等領(lǐng)域。RNAi技術(shù)通過特異性抑制靶標(biāo)基因的表達(dá),導(dǎo)致與目標(biāo)基因相關(guān)的生理功能缺失,或形成功能缺陷,從而對靶標(biāo)基因功能進(jìn)行分析研究,尤其是在基因敲除、基因編輯平臺不太成熟的非模式物種中,該技術(shù)極具優(yōu)勢。

在生物醫(yī)藥領(lǐng)域,自RNAi技術(shù)被發(fā)現(xiàn)以來,就被眾多醫(yī)藥巨頭給予極大的關(guān)注,并在此領(lǐng)域進(jìn)行了規(guī)模龐大的布局,同時涌現(xiàn)很多基于RNAi技術(shù)成立的醫(yī)藥科技公司,使得這一技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域呈現(xiàn)暴發(fā)性的發(fā)展。2018年,Alnylam公司開發(fā)的全球首款RNAi藥物patisiran獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(U.S. Food and Drug Administration,FDA)上市許可,這是全球第一款RNAi藥物,主要用于治療成人遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素介導(dǎo)淀粉樣變性引起的多發(fā)性神經(jīng)病變,該疾病每年治療費用高達(dá)34.5萬美元。隨后,在2019年和2020年,同樣由Alnylam公司開發(fā)的第二款、第三款RNAi新藥分別上市,這3款藥物均為針對罕見病治療的孤兒藥。2020年12月,歐盟批準(zhǔn)了諾華公司研發(fā)的用于治療原發(fā)性高膽固醇血癥的RNAi藥物inclisiran,實現(xiàn)了RNAi藥物從罕見病到常見慢性疾病的飛躍,該藥于2021年12月獲得美國FDA的上市許可。這些新藥的出現(xiàn),改變了現(xiàn)有醫(yī)藥研發(fā)的格局,同時再次觸發(fā)了各大醫(yī)藥公司對該領(lǐng)域的投資熱情,僅2021年,全球RNAi療法領(lǐng)域發(fā)生64起投融資事件(含IPO,initial public offering,首次公開募股),總金額超50億美元。此外,還有46項RNAi藥物的合作交易發(fā)生(見2021年全球RNA療法領(lǐng)域投融資年報)。

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,RNAi技術(shù)同樣被寄予厚望,尤其是在病蟲害防控領(lǐng)域,被稱為″農(nóng)藥史上的第三次革命″。利用RNAi技術(shù)沉默有害生物生長發(fā)育過程中重要基因的表達(dá),導(dǎo)致其生長發(fā)育障礙或者死亡,從而降低有害生物對農(nóng)作物的侵害,實現(xiàn)病蟲害防治,達(dá)到農(nóng)作物安全生產(chǎn)的目的。利用RNAi技術(shù)進(jìn)行病蟲害防治具有防治目標(biāo)專一性、靶標(biāo)開發(fā)的便捷性、應(yīng)用方便易于操作、綠色無污染、無殘留及環(huán)境兼容性強等眾多優(yōu)勢,完全符合公眾對于綠色農(nóng)藥的需求。在RNA生物農(nóng)藥研發(fā)領(lǐng)域,目前已經(jīng)有產(chǎn)品上市或準(zhǔn)備上市。拜耳公司的第一款表達(dá)昆蟲雙鏈RNA(double-strand RNA,dsRNA)的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米于2017年獲得美國環(huán)境保護(hù)署(U.S. Environmental Protection Agency,EPA)的種植許可,2021年獲得中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因安全許可證書,預(yù)計2022年推廣上市；同時,多款基于噴灑的RNA生物農(nóng)藥已經(jīng)提交或者準(zhǔn)備提交EPA審核。

我國在利用RNAi技術(shù)進(jìn)行病蟲害防治領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究中,起步較早、起點較高,但是在應(yīng)用領(lǐng)域,由于缺乏規(guī)?；?、系統(tǒng)化的研究投入,目前,與國際農(nóng)化巨頭的研究還存在一定的差距。在此背景下,迫切需要我們在該領(lǐng)域加快研究步伐,同時建立與RNA生物農(nóng)藥相匹配的研發(fā)、應(yīng)用、生產(chǎn)等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn),完善相應(yīng)的法律法規(guī),對生產(chǎn)進(jìn)行指導(dǎo)與監(jiān)管,以此來促進(jìn)RNA生物農(nóng)藥的商業(yè)化進(jìn)程?；诖?本文就目前國際RNA生物農(nóng)藥公司的研究及開發(fā)現(xiàn)狀,以及一些國家對于RNA生物農(nóng)藥相關(guān)政策進(jìn)行綜述,為RNA生物農(nóng)藥發(fā)展形勢及政策解讀提供參考。

02

RNA生物農(nóng)藥商業(yè)化進(jìn)程

2.1  國際上主要從事RNA生物農(nóng)藥研發(fā)的公司及其發(fā)展現(xiàn)狀

自RNAi現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來,20余年的實踐證明,各大農(nóng)藥公司對于RNA生物農(nóng)藥的研制經(jīng)歷了快速入場、瓶頸期撤離、技術(shù)突破后再次入場及高速發(fā)展等幾個時期。1998年,RNAi技術(shù)一經(jīng)發(fā)現(xiàn),國際上幾大農(nóng)藥公司,如拜耳、孟山都、先正達(dá)、巴斯夫等均投入大量的人力和財力開始了RNA生物農(nóng)藥的開發(fā)以及應(yīng)用研究,掀起了RNA生物農(nóng)藥研發(fā)的第一波熱潮。但是,由于dsRNA生產(chǎn)、遞送及保護(hù)技術(shù)尚未解決,從2010年到2018年,大量資本紛紛離場,RNA生物農(nóng)藥的研發(fā)經(jīng)歷了相當(dāng)長時間的低谷期。近年來,隨著RNAi藥物研發(fā)的蓬勃發(fā)展以及相關(guān)技術(shù)的突破,針對RNA生物農(nóng)藥的研發(fā)也進(jìn)入了快速發(fā)展時期。目前,拜耳(孟山都)在轉(zhuǎn)基因玉米(MON87411)以及噴灑型RNA生物農(nóng)藥(BioDirect)應(yīng)用研發(fā)方面,均取得了非常顯著的成果,基本實現(xiàn)了商品化。先正達(dá)在利用RNAi技術(shù)進(jìn)行病蟲害防控方面也取得了極具商業(yè)價值的成果。同時,一些新興農(nóng)化公司及大量資本也加入到RNA生物農(nóng)藥開發(fā)的行列,極大地促進(jìn)了RNA生物農(nóng)藥的研發(fā)及商業(yè)化進(jìn)程。

2.1.1  dsRNA生產(chǎn)相關(guān)公司概況

成立于2008年的Greenlight Biosciences,主要致力于人類健康和農(nóng)用RNA產(chǎn)品的生產(chǎn)和研發(fā)。該公司建立了多種平臺的dsRNA生產(chǎn)工藝,其專有的無細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng),能夠?qū)sRNA的生產(chǎn)成本控制在1美元/g的價格,并且能夠保證生產(chǎn)dsRNA的技術(shù)級活性成分(technical grade active ingredient)。該公司目前有多款抗病、抗蟲的RNA生物農(nóng)藥產(chǎn)品在積極研發(fā),并準(zhǔn)備或已經(jīng)提交EPA審批。公司因擁有較為成熟的RNA生產(chǎn)平臺,近年來得到資本市場的廣泛關(guān)注,從2013年至2020年,獲得數(shù)億美元融資,其中2020年6月16日,D輪超額認(rèn)購融資1.02億美元,成為2020年度全球農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域融資排名第二的投融資事件；2021年5月20日,拜耳將其防治蜜蜂狄斯瓦螨(Varroa destructor)的RNAi相關(guān)專利與Greenlight Biosciences共享,授權(quán)該公司進(jìn)行dsRNA合成；2021年9月21日,該公司宣布其在紐約羅徹斯特的制造工廠開業(yè),投入使用后,預(yù)計dsRNA的年產(chǎn)量可達(dá)100噸級規(guī)模；2021年8月10日,Greenlight Biosciences在無任何產(chǎn)品商業(yè)化的背景下,與SPAC Environmental Impact Acquisition Crop完成12億美元并購,在納斯達(dá)克上市。Greenlight Biosciences表示,該交易從SPAC獲得2.82億美元以及1.05億美元的PIPE(上市后私募投資,private investment in public equity)融資。這些收入將用于開發(fā)基于RNA的殺蟲劑、流感候選疫苗以及其他未被滿足的醫(yī)療需求,該公司預(yù)計在2022年推出首款產(chǎn)品(https://greenlightbiosciences.com/)。

美國另外一家專門從事dsRNA高效、經(jīng)濟、大規(guī)模生產(chǎn)的公司RNAgri,宣稱其dsRNA合成平臺能夠?qū)sRNA的生產(chǎn)成本控制在1美元/g,該公司于2020年6月18日被RNAissance Ag LLC收購。RNAissance Ag LLC是2019年1月24日由投資公司TechAccel LLC(https://techaccel.net/)和Donald Danforth Plant Science Center共同成立的子公司,專門開發(fā)針對小菜蛾(Plutella xylostella)的噴霧式RNA生物農(nóng)藥。2021年,由TechAccel LLC在圣路易斯建立新的辦公室(TechAccel LLC和RNAissance Ag共同使用),用于RNA生物農(nóng)藥相關(guān)的小規(guī)模實驗研發(fā)、生產(chǎn)、發(fā)酵(https://www.rnaissanceag.net/)。

韓國的Genolution公司開發(fā)出一種有效程序,通過發(fā)酵平臺合成毫克(mg)至千克(kg)規(guī)模的dsRNA(200～800 bp)(http://genolution.co.kr/)。此外,總部位于加拿大溫哥華的Renaissance BioScience公司建立了以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)發(fā)酵生產(chǎn)dsRNA的技術(shù)平臺,通過在酵母中表達(dá)針對不同物種靶標(biāo)基因的dsRNA,用于害蟲防控。2021年9月,該公司宣布,基于噴灑的針對馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)的RNA生物農(nóng)藥產(chǎn)品,在一項獨立測試中對幼蟲的致死率達(dá)到98.3%,大大降低了馬鈴薯甲蟲對作物造成的損害(https://renaissancebioscience.com/)。

上述公司的主要優(yōu)勢均集中在dsRNA的生產(chǎn)上。通過這些公司的不斷開發(fā),dsRNA的生產(chǎn)成本從2008年的12,000美元/g降到了2021年的1美元/g。通常情況下,dsRNA的使用量非常低,每英畝(約0.4公頃)僅需1～5 g。由此看來,目前的dsRNA生產(chǎn)成本已經(jīng)完全能夠滿足商業(yè)應(yīng)用。解決了dsRNA的大量生產(chǎn)和價格問題,預(yù)示著RNA生物農(nóng)藥商業(yè)化應(yīng)用的根本問題得到了有效解決。

2.1.2  dsRNA遞送研發(fā)相關(guān)公司概況

dsRNA在環(huán)境中的穩(wěn)定性對于RNA生物農(nóng)藥的應(yīng)用至關(guān)重要。目前已有多家公司專注于解決該問題,并開發(fā)出了獨特的RNA包被及制劑平臺。例如,初創(chuàng)公司AgroSpheres開發(fā)了一種專有的生物顆粒平臺,該平臺由缺乏染色體的小型球形細(xì)胞組成,可以封裝dsRNA,從而減緩dsRNA的降解,同時增強其在病蟲害中的傳遞(https://agrospheres.com/)。近年來,AgroSpheres已經(jīng)獲得多項融資,并與幾家大型全球公司建立合作伙伴關(guān)系；NanoSUR公司開發(fā)了一個專有平臺來改良生產(chǎn)的dsRNA,通過一定的包被,使其成為MdsRNA,能夠提高跨膜效率,防止其被快速降解,進(jìn)而提高RNA生物農(nóng)藥的效率(http://www.nanosur.com/)；Trillium Ag開發(fā)了新型農(nóng)業(yè)生物平臺Agrisomes,能夠通過對dsRNA進(jìn)行修飾和組裝,提高dsRNA的靶向性、特異性、遞送效率及穩(wěn)定性,進(jìn)而克服農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中RNAi應(yīng)用的很多關(guān)鍵障礙(http://www.trilliumag.com/)。這些公司研發(fā)的核酸包被平臺,大大提高了dsRNA在環(huán)境中的穩(wěn)定性,從而加快了RNA生物農(nóng)藥的商業(yè)化進(jìn)程。

2.1.3  我國RNA生物農(nóng)藥應(yīng)用研究現(xiàn)狀

我國在RNA生物農(nóng)藥研發(fā)領(lǐng)域的起點比較高,最早在2007年,中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院陳曉亞院士團隊與孟山都公司同步作出了具有里程碑意義的研究成果,隨后大量的研究團隊在這一領(lǐng)域進(jìn)行了各個層面的深入研究。如中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心苗雪霞團隊在多物種靶標(biāo)基因庫構(gòu)建、制劑配方優(yōu)化、規(guī)?；a(chǎn)體系以及安全性評估等領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究；中國科學(xué)院微生物研究所郭惠珊團隊利用跨界RNAi技術(shù),構(gòu)建了棉花抗黃萎病體系；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所王桂榮團隊針對棉花害蟲綠盲蝽(Apolygus lucorum)構(gòu)建了植物介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)基因玉米與大豆系統(tǒng)；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)沈杰團隊通過納米包被技術(shù)顯著提高了dsRNA的穩(wěn)定性,進(jìn)而提高昆蟲RNAi效率；中山大學(xué)張文慶團隊以及山西大學(xué)張建珍團隊針對褐飛虱(Nilaparvata lugens)和飛蝗(Locusta migratoria)的靶標(biāo)基因篩選均取得了較好的研究進(jìn)展。但是,我國在成果轉(zhuǎn)化、產(chǎn)業(yè)化及商業(yè)化程度上顯著落后于國際水平。同時,由于國內(nèi)大型農(nóng)藥企業(yè)的缺失,目前尚無成熟的RNA生物農(nóng)藥產(chǎn)品。截至2022年2月,我國基于RNAi技術(shù)的生物農(nóng)藥企業(yè),僅有上海植生優(yōu)谷生物技術(shù)有限公司在棉蚜(Aphis gossypii)、桃蚜(Myzus persicae)、黃曲條跳甲(Phyllotreta striolata)等害蟲的田間測試均取得了較好的防治效果,同時,在dsRNA規(guī)?；a(chǎn)方面取得了實質(zhì)性的進(jìn)展,計劃于2023年提交農(nóng)藥登記申請；此外,以上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院首席研究員唐雪明為創(chuàng)始人的硅羿科技(上海)有限公司,于2021年通過全國農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)化委員會審核,獲得了3張RNA生物農(nóng)藥--″核酸干擾素″命名函。其主要為針對煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的核酸干擾素,目前已經(jīng)進(jìn)入田間測試階段(https://www.zhongqiwang.cn/index.php?s=/qita/7016.html)。

2.2  RNA生物農(nóng)藥商品化進(jìn)展

RNAi技術(shù)在農(nóng)業(yè)病蟲害防治中的應(yīng)用方式主要有兩種：一是通過轉(zhuǎn)基因手段在植物中表達(dá)針對病蟲害靶標(biāo)基因的dsRNA,從而實現(xiàn)病蟲害防控,是一種以轉(zhuǎn)基因作物為主的植物源保護(hù)劑(plant incorporated protectant,PIP)；二是直接將dsRNA制成噴劑,利用噴灑的方式進(jìn)行害蟲防治,即非植物源保護(hù)劑(non plant incorporated protectant,non-PIP)。

2.2.1  植物源保護(hù)劑形式的RNAi產(chǎn)品

針對植物源保護(hù)劑形式的產(chǎn)品,2017年,孟山都公司(現(xiàn)拜耳)新一代轉(zhuǎn)基因玉米MON87411獲得EPA批準(zhǔn),隨后在多個國家獲得種植許可,用于防治玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera)。該產(chǎn)品在玉米中同時表達(dá)了Bt蛋白(Cry3Bb1),耐除草劑基因cp4 epsps,以及針對玉米根螢葉甲Snf7的dssnf7,MON87411是國際上首例在植物中表達(dá)dsRNA的產(chǎn)品。2021年1月21日,拜耳宣布該產(chǎn)品獲得中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的轉(zhuǎn)基因生物安全證書(進(jìn)口和食品/飼料用途),進(jìn)一步加速了該產(chǎn)品的商業(yè)化進(jìn)程。同時,拜耳預(yù)計該產(chǎn)品于2022年在美國進(jìn)行商業(yè)化種植,2023年在加拿大進(jìn)行推廣,未來幾年內(nèi),推廣1,500萬英畝(約600萬公頃)。2021年2月9日,澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局(FSANZ)批準(zhǔn)基于RNAi的耐除草劑和抗蟲玉米產(chǎn)品DP23211用于食品,該轉(zhuǎn)基因玉米同時表達(dá)了dsDvSSJ1和IPD072Aa蛋白用于防治玉米根蟲(Diabrotica spp.)(https://www.foodstandards.gov.au/code/applications/Pages/A1202.aspx)。

此外,還有多個基于RNAi技術(shù)的轉(zhuǎn)基因植物獲批,進(jìn)行商業(yè)化種植。2014年,JRSimplot的InnateÔ(SPS-ØØE12-8(E12))馬鈴薯在美國獲準(zhǔn)種植,隨后在馬來西亞、加拿大、墨西哥、日本、澳大利亞和新西蘭等多個國家獲批。該種馬鈴薯攜帶4個RNAi基因,其中3個針對″改善″丙烯酰胺水平,第4個針對黑斑病毒控制基因(https://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=381)。

2018年,拜耳(孟山都)轉(zhuǎn)基因大豆(MON87705)商業(yè)化(https://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=177)。該大豆能夠通過特定基因修飾改善脂肪酸譜,而且該公司已申請該作物的國際出口。

我國在植物源保護(hù)劑形式的RNAi產(chǎn)品研發(fā)和應(yīng)用方面也取得了較好的研究結(jié)果。中國科學(xué)院微生物研究所郭惠珊團隊長期致力于應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行棉花抗黃萎病的研究工作,2019年,該團隊與新疆華晨合豐投資有限公司達(dá)成戰(zhàn)略合作協(xié)議,該公司將在最短時間內(nèi)資助課題組改善中試、生產(chǎn)性試驗以及品種審定等環(huán)節(jié),加速成果轉(zhuǎn)化和產(chǎn)業(yè)化速度。

2.2.2  非植物源保護(hù)劑形式的RNA生物農(nóng)藥

2019年,拜耳向美國EPA提交了新產(chǎn)品BioDirect,該產(chǎn)品是利用RNAi原理,通過dsRNA進(jìn)行蜜蜂狄斯瓦螨防治,這是向EPA提交的第一份外源應(yīng)用的RNA生物農(nóng)藥活性成分。2021年5月,拜耳將該部分專利授權(quán)給Greenlight Biosciences進(jìn)行dsRNA的生產(chǎn),新產(chǎn)品預(yù)計2024年上市。另外,Greenlight Biosciences公司對外宣布,將在2022年向EPA提交注冊一種用于防控馬鈴薯甲蟲的dsRNA產(chǎn)品。同時,該公司也在積極研發(fā)針對白粉病以及灰霉病的RNAi產(chǎn)品,預(yù)計2025年能夠作為第一款殺菌劑進(jìn)行批準(zhǔn)上市。

此外,還有多家公司布局直接噴灑型的RNAi產(chǎn)品。RNAissance Ag LLC在積極開發(fā)針對小菜蛾的噴霧式RNA生物農(nóng)藥；先正達(dá)公司在進(jìn)行馬鈴薯甲蟲RNAi殺蟲劑的研制,并且預(yù)計在7～10年實現(xiàn)商業(yè)化。

從目前的研發(fā)狀況來看,基于RNAi技術(shù)的抗病蟲產(chǎn)品在未來幾年具備上市的可能性。目前,我國尚無提交注冊的RNAi農(nóng)用相關(guān)產(chǎn)品。

03

國際上對RNA生物農(nóng)藥相關(guān)政策及解讀

3.1  經(jīng)濟合作與開發(fā)組織(OECD)文件解讀

目前為止,還沒有任何一個外源施用的dsRNA殺蟲劑被批準(zhǔn)使用,然而,一旦有該類產(chǎn)品獲準(zhǔn)上市,會影響到整個農(nóng)藥行業(yè)的格局。因此,國際上相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)家及農(nóng)藥公司也在密切關(guān)注RNA生物農(nóng)藥的動向。

2019年4月10～12日,經(jīng)濟合作與開發(fā)組織(Organization for Economic Cooperation and Development,OECD)在巴黎組織會議討論dsRNA作為外用植物保護(hù)劑的使用情況,該會議由來自學(xué)術(shù)界、工業(yè)界和政府的60余名成員參加,出席會議的國家包括澳大利亞、奧地利、比利時、加拿大、捷克共和國、丹麥、愛沙尼亞、法國、德國、匈牙利、荷蘭、瑞士、英國和美國,此外,代表歐盟委員會的相關(guān)專家也出席了會議。會議就RNAi相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā),外部使用dsRNA的環(huán)境歸屬問題,以及在非目標(biāo)生物(non-target organism,NTO)中的暴露情況進(jìn)行了討論與總結(jié)。2020年9月25日,OECD在Series on Pesticides No.104在線正式發(fā)表″關(guān)于噴灑或外部施用dsRNA殺蟲劑的環(huán)境風(fēng)險評估的考慮″,就OECD會議內(nèi)容進(jìn)行了總結(jié)。

會議就噴灑型RNA生物農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)行討論,主要包括RNA生物農(nóng)藥結(jié)構(gòu)、特點、商品化類型；基于dsRNA的產(chǎn)品監(jiān)管和政策；dsRNA在環(huán)境中的命運、對非靶標(biāo)物種的影響、環(huán)境風(fēng)險評估、對人類健康風(fēng)險評估,并對一些目前尚不確定的因素進(jìn)行了分析。主要內(nèi)容可概括為如下幾點：

(1)針對噴灑型RNA生物農(nóng)藥的研發(fā)和應(yīng)用,制劑和配方至關(guān)重要。因為相比于傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥,dsRNA在環(huán)境中更易于降解,合適的制劑和配方對于dsRNA的吸收和穩(wěn)定性非常關(guān)鍵。此外,會議認(rèn)為,現(xiàn)有的評價Bt轉(zhuǎn)基因作物穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)可以作為dsRNA相關(guān)產(chǎn)品在進(jìn)行環(huán)境歸宿以及穩(wěn)定性評估的參考。

(2)RNA產(chǎn)品的環(huán)境命運和對非靶標(biāo)物種的影響至關(guān)重要。會議討論了生物信息學(xué)在進(jìn)行潛在風(fēng)險評估中的應(yīng)用,由于不同物種對于dsRNA的攝取方式不同,RNAi機制不同,因此利用生物信息學(xué)在進(jìn)行脫靶效應(yīng)的風(fēng)險評估方面的價值是有限的,單獨對于序列的生物信息學(xué)分析不能作為對非靶標(biāo)物種影響的唯一預(yù)測指標(biāo),但是其在dsRNA產(chǎn)品的設(shè)計階段以及對于非靶標(biāo)物種進(jìn)行研究時至關(guān)重要。

(3)RNA產(chǎn)品對人類健康及潛在影響問題。OECD會議認(rèn)為,dsRNA作為核酸類物質(zhì),與人類及其他可能攝取的生物體中的基因序列組成相同。核酸是植物、動物性食品和飼料的天然成分,是人類和動物日常消耗品。同時,人類和其他脊椎動物中存在顯著的生理和生化屏障,比如唾液及消化道中的核酸酶、胃液中的pH差異、細(xì)胞中的溶酶體等都影響外源dsRNA核酸的攝取。因此,dsRNA對于人類健康來說,是相對安全的。

(4)一些目前尚不確定的問題,也可能是影響RNA生物農(nóng)藥的重要因素。比如一些生物中含有RNAi的信號放大效應(yīng),這會影響到dsRNA環(huán)境暴露的評估；不同生物體中不同的RNAi通路相關(guān)機制,可能產(chǎn)生相應(yīng)的脫靶效應(yīng)；同時,如果隨著dsRNA的大量使用,隨之而來可能產(chǎn)生對RNA生物農(nóng)藥的抗性問題,也是需要考慮的。

此外,根據(jù)RNAi機制和作用原理,相比于傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥,以dsRNA為基礎(chǔ)物質(zhì)的生物農(nóng)藥可能需要更長時間的見效期,這也是在進(jìn)行環(huán)境及毒理評估時應(yīng)該考慮的問題。

OECD會議的召開,以及相關(guān)工作文件的發(fā)表,說明RNA生物農(nóng)藥已經(jīng)逐漸被政府了解、重視,并對相關(guān)問題進(jìn)行考慮。這也將進(jìn)一步促進(jìn)RNA生物農(nóng)藥研發(fā)、上市、推廣、應(yīng)用等各個環(huán)節(jié)。

3.2  歐美一些國家對于RNA生物農(nóng)藥的歸類

基于RNAi技術(shù)的RNA生物農(nóng)藥具有眾多的優(yōu)勢,相比于傳統(tǒng)的化學(xué)殺蟲劑,其具有更強的特異性,且容易在環(huán)境中降解,因此,是一種綠色無污染的生物農(nóng)藥。另外其研發(fā)較易,開發(fā)費用低,技術(shù)層面的問題較易解決,但在其商業(yè)化應(yīng)用之前,仍需要經(jīng)過不同國家相關(guān)部門的安全評估和授權(quán)程序。

3.2.1  美國對RNA生物農(nóng)藥的歸類及安全性評價

針對植物中表達(dá)dsRNA的植物源保護(hù)劑,美國環(huán)境保護(hù)署(U.S. EPA)已經(jīng)批準(zhǔn)拜耳的轉(zhuǎn)基因玉米MON87411,該轉(zhuǎn)基因玉米同時表達(dá)Cry3Bb1、CP4EPSPS及dsDvSnf7。EPA針對MON87411中產(chǎn)生的成分dsDvSnf7作為生物化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了環(huán)境持久性研究,評估了其在陸地及水環(huán)境中的歸宿,同時評估了針對非靶標(biāo)生物鳥類、哺乳動物、淡水無脊椎動物、淡水魚、海洋和河口魚類及無脊椎動物,非靶標(biāo)昆蟲、蜜蜂及其他無脊椎動物的毒性及安全性。筆者注意到,在進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險評估時,某些物種只用到了生物信息學(xué)分析的方法,并以分析結(jié)果作為環(huán)境評估的依據(jù)。比如,對鳥類的紅隼、石鴿和綠頭鴨,哺乳動物中的肉牛、家養(yǎng)狗、馬、家鼠、挪威大鼠、豬,蜜蜂和大黃蜂基因組進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。dsDvSnf7對非靶標(biāo)物種的影響主要是對廣泛類群以及最有可能受到影響的物種的測試,主要評估了包括物種生存、生長、發(fā)育和繁殖在內(nèi)的各項影響,并選擇足夠長的時間評估潛在的不良反應(yīng)。同時,考慮到實驗中dsRNA可能降解的問題,采取了足夠高的濃度進(jìn)行測定。EPA的結(jié)論顯示,dsDvSnf7不太可能對非靶標(biāo)物種具有生物學(xué)意義上的影響(https://www.epa.gov/sap/meeting-materialsjanuary-28-2014-scientific-advisory-panel,https://www.epa.gov/sap/meeting-materials-september-27-28-2016-scientific-advisory-panel)。值得注意的是,EPA對該產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險評估過程中,大量的測試并不是通過轉(zhuǎn)基因植物或者植物提取物,而是通過合成游離的dsDvSnf7進(jìn)行的,這也為未來基于直接利用dsRNA生物農(nóng)藥的環(huán)境評估提供了一個參考。

針對直接使用的非植物源RNA生物農(nóng)藥,目前尚未有產(chǎn)品獲得EPA批準(zhǔn)。在美國,針對各類型的此種產(chǎn)品,主要由《聯(lián)邦殺蟲劑、殺菌劑和滅鼠劑法》(FIFRA)和《聯(lián)邦食品、藥品和化妝品法》(FFDCA)進(jìn)行農(nóng)藥的規(guī)范和管理,并授權(quán)EPA對農(nóng)藥進(jìn)行登記與評估。所有的殺蟲產(chǎn)品需要經(jīng)過EPA注冊、登記,才能進(jìn)行后續(xù)的生產(chǎn)、運輸和銷售。田間測試也需要經(jīng)過實驗使用許可,EPA評估農(nóng)藥最終使用產(chǎn)品的注冊,并對活性成分和實際產(chǎn)品進(jìn)行評估。美國多數(shù)州參考EPA的審查數(shù)據(jù)和結(jié)論,但是也有少數(shù)幾個州需要向其提交數(shù)據(jù),進(jìn)行隨后的評估。

針對噴灑型的dsRNA產(chǎn)品,由于目前尚未有產(chǎn)品被批準(zhǔn)上市,因此,并沒有關(guān)于噴灑型dsRNA類農(nóng)藥的明確歸類問題。但是,基于上述美國對植物源RNA生物農(nóng)藥的檢測和管理可以看出,美國EPA更傾向于將其作為生化殺蟲劑進(jìn)行相關(guān)的要求,關(guān)于這一點,可以參照EPA頒布的″聯(lián)邦法規(guī)第40篇(CFR)第158部分″,以及″Subpart U-Biochemical Pesticides of 40 CFR Part 158″的數(shù)據(jù)要求,對農(nóng)藥活性成分和產(chǎn)品進(jìn)行評估。

3.2.2  歐盟及其他國家對RNA生物農(nóng)藥的歸類及相關(guān)政策

在歐盟,任何植物保護(hù)產(chǎn)品(plant protection products,PPP)(農(nóng)藥),均需要對其活性物質(zhì)和最終產(chǎn)品進(jìn)行授權(quán),其中活性物質(zhì)的授權(quán)是植物保護(hù)產(chǎn)品(農(nóng)藥)授權(quán)的先決條件。歐盟委員會(European Commission)依托歐洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)對活性物質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險評估與指導(dǎo)。此外,OECD、歐洲和地中海地區(qū)植物保護(hù)組織(European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO)和EFSA編制的指導(dǎo)文件對這些法規(guī)進(jìn)行了補充,描述了活性物質(zhì)和農(nóng)藥產(chǎn)品風(fēng)險評估的方法學(xué)要求。

在歐盟,主要將PPP分為化學(xué)品、微生物以及基礎(chǔ)物質(zhì),并沒有美國以及中國農(nóng)藥分類體系中生物農(nóng)藥這個類別,由于dsRNA的PPP并不屬于微生物以及基礎(chǔ)物質(zhì)范疇,目前還沒有任何具體的指導(dǎo)文件定義基于dsRNA的PPP授權(quán),但是OECD(2020)給出了一定的指導(dǎo)意見。目前基于dsRNA的PPP在歐盟仍被視為化學(xué)PPP,但也有可能會根據(jù)具體情況決定對特定關(guān)注領(lǐng)域的風(fēng)險評估進(jìn)行豁免或者調(diào)整。

盡管目前還沒有針對dsRNA產(chǎn)品的法規(guī)政策,但在歐盟,以dsRNA作為活性物質(zhì)的PPP應(yīng)用預(yù)計在未來幾年內(nèi)實現(xiàn)。因此,歐盟主管當(dāng)局應(yīng)開始深入討論未來如何充分評估此類產(chǎn)品的風(fēng)險。目前,EFSA將RNA生物農(nóng)藥風(fēng)險評估定義為安全,因為噴灑的dsRNA對動物、人類造成的風(fēng)險很低。具有決定性的論點認(rèn)為,由于噴灑dsRNA需要克服較多的生物和物理屏障,因此,口服RNAi產(chǎn)品對于干擾人類基因表達(dá)的概率很低,造成風(fēng)險的可能也很小。

2018年5月,新西蘭環(huán)境保護(hù)局決策委員會(the Decision-Making Committee of the New Zeal and Environmental Protection Authority)發(fā)布了一份公告,結(jié)論是用dsRNA處理(包括攝取、吸入和吸收)的真核細(xì)胞或者生物體不屬于新的生物。因為通過dsRNA處理真核生物,并不能修飾及改變其染色體DNA,也不能產(chǎn)生可遺傳的變異,不屬于新的生物體,因此,無需進(jìn)行風(fēng)險評估。同時,新西蘭初級產(chǎn)業(yè)部(the Ministry of Primary Industries)將RNA列入″可忽略不計的風(fēng)險登記冊″。因此,在新西蘭,任何人都可以在開放環(huán)境中使用任何dsRNA材料處理真核生物(尚未被列為生物安全威脅),而無需任何事先批準(zhǔn)。

04

RNA生物農(nóng)藥亟需解決的問題

4.1  RNA生物農(nóng)藥技術(shù)層面需要解決的問題

依據(jù)目前的研發(fā)進(jìn)度,RNA生物農(nóng)藥極有可能在未來幾年上市。目前來看,RNA生物農(nóng)藥在技術(shù)層面上還有一些問題需要解決。

4.1.1  高效RNAi靶標(biāo)基因的篩選

RNA生物農(nóng)藥優(yōu)勢之一是利用低劑量dsRNA即能夠引起高效RNAi效應(yīng),因此,獲得目標(biāo)生物高效致死的RNAi靶標(biāo)基因是研制RNA生物農(nóng)藥的關(guān)鍵。目前對于靶標(biāo)基因的篩選和獲得,可以通過以下幾種方式：(1)已知的病蟲生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因,作為可能的靶標(biāo)基因進(jìn)行篩選；(2)通過相近物種中已知的高效靶標(biāo)基因的同源序列基因進(jìn)行篩選；(3)通過測序技術(shù),對病蟲不同組織、不同發(fā)育階段基因進(jìn)行研究和篩選,從而獲得高效致死作用的靶標(biāo)基因。通過這些方式,已經(jīng)獲得多個重要害蟲的靶標(biāo)基因。但是,在篩選靶標(biāo)基因的同時,也發(fā)現(xiàn)不同種類昆蟲RNAi效率不同。比如,相比于鞘翅目、直翅目昆蟲,鱗翅目昆蟲RNAi效率較低,高效致死作用的靶標(biāo)基因篩選也相對困難。這可能是由于昆蟲自身特異基因、中腸環(huán)境、RNAi通路機制存在差異所導(dǎo)致。在針對此類昆蟲篩選靶標(biāo)基因時,就需要綜合考慮。由于同一靶標(biāo)基因在不同物種中行使的功能并不完全一致、不同作用機制的靶標(biāo)基因抗性程度可能存在差異、不同物種中RNAi作用機制存在差異,而這些都是影響靶標(biāo)基因作用效果的重要因素,因此,在選擇靶標(biāo)基因的過程中均需考慮。

4.1.2  dsRNA的生產(chǎn)成本

dsRNA合成成本是RNA生物農(nóng)藥能否在田間施用的至關(guān)重要的因素。合成dsRNA主要包括化學(xué)合成、體外合成以及微生物發(fā)酵合成3種方式。化學(xué)合成成本高,并且隨著dsRNA合成長度的增加,合成錯誤率增加,一般僅適用于實驗室研究的小劑量使用,而不適合大規(guī)模生產(chǎn)；體外無細(xì)胞系統(tǒng)的合成方式主要通過表達(dá)dsRNA的元件,之后通過對合成體系進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化,進(jìn)行體外合成并純化。目前,基于此種合成方法,美國Greenlight Biosciences公司研發(fā)了無細(xì)胞合成體系,能夠?qū)sRNA的合成成本控制在1美元/g以內(nèi),其成本已經(jīng)能夠滿足田間規(guī)?；瘧?yīng)用的要求；利用微生物發(fā)酵表達(dá)合成dsRNA也是目前可能規(guī)模化應(yīng)用的方式之一,已在包括大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等多種底盤細(xì)胞中構(gòu)建并得到合成dsRNA的菌株,通過提取微生物發(fā)酵產(chǎn)物或者將微生物滅活后處理相關(guān)的靶標(biāo)生物,均能夠產(chǎn)生相應(yīng)的RNAi表型。例如加拿大Renaissance BioScience公司通過專屬的酵母載體表達(dá)dsRNA,飼喂馬鈴薯甲蟲,能夠精準(zhǔn)地抑制靶標(biāo)基因的表達(dá),并且對馬鈴薯甲蟲致死率高達(dá)98.3%,達(dá)到保護(hù)植株的功效。

4.1.3  dsRNA的穩(wěn)定性

dsRNA屬于核酸類物質(zhì),在復(fù)雜的大田環(huán)境(pH、光照、雨水、微生物等)中或者存在核酸酶的情況下,極其容易發(fā)生降解。因此,RNA生物農(nóng)藥的穩(wěn)定性及貨架期對于此類產(chǎn)品的開發(fā)至關(guān)重要。目前,已經(jīng)有多種手段提高dsRNA的穩(wěn)定性。例如,通過納米包被,顯著提高dsRNA的穩(wěn)定性；通過BioClay的包被,能夠顯著提高dsRNA在葉片上的存在時長,增加噴灑型dsRNA的作用效率。同時,也有多家公司專門開展針對dsRNA穩(wěn)定性的各種助劑以及納米顆粒的研發(fā),結(jié)果顯示,添加各種輔助產(chǎn)品可顯著增加dsRNA在環(huán)境及靶標(biāo)生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。

4.1.4  其他問題

除上述幾個主要問題外,RNA生物農(nóng)藥的遞送效率、RNA生物農(nóng)藥在進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險評估時殘留量的檢測等均為該類農(nóng)藥應(yīng)用之前亟需解決的關(guān)鍵問題。隨著科研機構(gòu)、相關(guān)企業(yè)以及投資機構(gòu)對該領(lǐng)域的進(jìn)一步深耕,相信這些問題能夠迎刃而解,從而推動RNA生物農(nóng)藥的早日推廣使用。

4.2  RNA生物農(nóng)藥的環(huán)境評估及政策層面需要解決的問題

RNA生物農(nóng)藥能否早日實現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用,除了技術(shù)層面的問題之外,還面臨著可能的環(huán)境及政策層面需要解決的問題。

RNA生物農(nóng)藥在獲得農(nóng)藥許可證書之前,需要進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險評估。主要包括評估應(yīng)用過程中釋放的dsRNA在環(huán)境中的存在及降解情況,對非靶標(biāo)物種的影響,以及對人類健康存在的可能風(fēng)險。對于dsRNA含量,目前在實驗室條件下主要采用分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳及PCR進(jìn)行檢測,需要相對專業(yè)的實驗室環(huán)境。由于不同檢測方法的靈敏度存在差異,因此需要研發(fā)針對環(huán)境中痕量dsRNA的簡便、快速、高靈敏度檢測方法。目前,通過放射性同位素32P標(biāo)記的方法,可以顯著提高環(huán)境中dsRNA的檢測靈敏度。在對非靶標(biāo)物種的影響方面,除了采用傳統(tǒng)的急性及慢性毒理檢測手段之外,根據(jù)RNAi的作用機制(dsRNA僅對能夠良好匹配的目標(biāo)mRNA產(chǎn)生抑制作用),能否利用生物信息學(xué)手段對非靶標(biāo)物種的整個基因組序列進(jìn)行分析,預(yù)測目標(biāo)dsRNA對于非靶標(biāo)物種的可能影響？這種檢測方法的可信度以及能否作為一種技術(shù)手段或參考應(yīng)用于RNA生物農(nóng)藥的環(huán)境毒理檢測,也是需要深入探討的重要問題。

05

總結(jié)與展望

RNA生物農(nóng)藥具有眾多優(yōu)勢：(1)利用RNAi技術(shù)可以針對某種病害或蟲害設(shè)計物種專一性RNA生物農(nóng)藥,同時不影響非靶標(biāo)生物；(2)可以利用物種間的共有靶標(biāo)設(shè)計出針對多個物種的種間廣譜性RNA生物農(nóng)藥；(3)以dsRNA為主體形式的制劑在環(huán)境中能夠快速降解,在保證防治效率的前提下,殘留和環(huán)境污染問題幾乎可以忽略；(4)該技術(shù)只是暫時關(guān)閉害蟲某個基因的表達(dá),沒有改變生物體自身的基因組,不會產(chǎn)生可遺傳的變異,因此幾乎不影響生態(tài)系統(tǒng)；(5)靶標(biāo)基因的可替代性較高,不容易產(chǎn)生抗藥性；(6)RNA生物農(nóng)藥產(chǎn)品制劑具有純度高、起效快、無毒、無污染、防控范圍廣、價格低廉等化學(xué)農(nóng)藥和常規(guī)微生物農(nóng)藥所無法比擬的優(yōu)點,在市場競爭中擁有比較明顯的優(yōu)勢。

當(dāng)前RNA生物農(nóng)藥在全世界范圍內(nèi)發(fā)展迅猛,已有兩例基于轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)品(MON87411和DP23211)批準(zhǔn)上市,基于直接噴灑型的RNA生物農(nóng)藥,盡管沒有相應(yīng)的產(chǎn)品,但是,國際上多家農(nóng)化巨頭公司均有相關(guān)產(chǎn)品的大規(guī)模布局,預(yù)期近幾年會有相關(guān)的產(chǎn)品上市,而我國在此領(lǐng)域尚處于起步階段。RNA生物農(nóng)藥作為農(nóng)藥史上革命性產(chǎn)品,將是我國在農(nóng)藥領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)彎道超車的一次重要機遇。同時,RNA生物農(nóng)藥如何使用,環(huán)境釋放風(fēng)險評估等均是至關(guān)重要的問題,需要進(jìn)行充分的調(diào)研和商討。并且,針對直接噴灑型的RNA生物農(nóng)藥,目前可以通過微生物發(fā)酵獲得,也可以通過體外直接合成dsRNA產(chǎn)品,那么,對于兩種來源的dsRNA,能否歸于同一個類型,需要管理機構(gòu)充分考慮并進(jìn)行規(guī)范管理。目前,影響我國RNA生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化的瓶頸有兩個：一是dsRNA的低成本規(guī)?；a(chǎn)；二是相關(guān)政策的制訂及應(yīng)用許可。因此,加速推進(jìn)我國在RNA生物農(nóng)藥領(lǐng)域的深度布局,快速形成一批具有核心知識產(chǎn)權(quán)的新興農(nóng)藥公司,有助于樹立我國在該領(lǐng)域的國際地位。目前,我國已經(jīng)將RNA生物農(nóng)藥作為優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域,這說明,政府部門也已經(jīng)注意到RNA農(nóng)藥的發(fā)展前景,并對此進(jìn)行了相應(yīng)的規(guī)劃,這無疑對于RNA生物農(nóng)藥的發(fā)展是利好消息。當(dāng)然,快速推動RNA生物農(nóng)藥的發(fā)展與問世,還需要政府部門充分考慮我國的現(xiàn)狀,并積極制定相關(guān)的政策法規(guī),同時,也需要國內(nèi)傳統(tǒng)的農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)具有前瞻性視野,進(jìn)行長期布局,并吸引民間資本進(jìn)行規(guī)?；难邪l(fā)和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整,以快速推動RNA生物農(nóng)藥的應(yīng)用和商品化。