作者：曾令強、羅睿童、陳瓊、郝格非、朱曉磊、楊光富

琥珀酸脫氫酶 (succinate dehydrogenase, SDH)又稱為琥珀酸泛醌氧化還原酶 (succinate ubiquinoneoxidoreductase, SQR),其作為一類重要的殺菌劑靶標在農藥研究領域扮演著十分重要的角色。琥珀酸脫氫酶抑制劑 (succinate dehydrogenase inhibitor,SDHI) 具有高效、廣譜和環(huán)境友好等特點。自20世紀60年代第1個商品化SDHI 萎銹靈上市以來,歷經60 余年的發(fā)展,目前已有24個SDHI 商品化。然而,根據殺菌劑抗性行動委員會 (Fungicides Resistance Action Committee, FRAC)的統(tǒng)計數據顯示,已有20多種植物病原菌對SDHI 類殺菌劑表現出抗性,其中16種為田間報道的抗性,而且植物病原菌對現有商品化SDHI 的抗性水平已達到中等甚至高水平抗性。另外,市場上主流的SDHI多為吡唑聯苯類,該類化合物由于聯苯片段的存在使得其合成成本相對較高,且部分SDHI類殺菌劑對防治植物病害的活性不高,如異丙噻菌胺 雖然對子囊菌等引起的病害具有優(yōu)異的防治效果,但是對半知菌以及卵菌活性不佳。因此,發(fā)現合成成本較低且殺菌譜廣的新型SDHI顯得尤為重要。

華中師范大學楊光富課題組開發(fā)出了″藥效團連接碎片虛擬篩選″(pharmacophore-linked frag-ment virtual screening, PFVS) 方法,隨后基于此方法成功創(chuàng)制出了新型 SDHI 殺菌劑-氟苯醚酰胺,試驗代號：Y13149 (本文中化合物 11,圖式 1),中國專利申請?zhí)?201310502473.7,國際 PCT/CN2013/089220。生物活性測試結果表明,氟苯醚酰胺對水稻紋枯病和黃瓜白粉病具有卓越的防治效果,同時對小麥白粉病等病菌具有良好的抑制作用。目前該化合物已經轉讓給企業(yè)進行產業(yè)化開發(fā)?；诖?本文將從PFVS的角度出發(fā),對氟苯醚酰胺的創(chuàng)制過程予以介紹,重點分析其創(chuàng)制過程中的研究思路,以期給農藥研究人員創(chuàng)制新農藥以啟發(fā)。

1 藥效團連接碎片虛擬篩選

PFVS (圖1) 是一種基于分子碎片的藥物分子設計方法,該方法克服了傳統(tǒng)藥物設計方法中必須依賴生物物理技術進行碎片篩選及需要大量高純蛋白的不足,成功實現了分子碎片的高通量虛擬篩選,使得基于碎片的藥物設計方法成為一種更通用的分子設計方法?；谝种苿┡c靶標之間的作用機制,PFVS方法的核心思想是在保留抑制劑關鍵藥效團的前提下,對其他部分進行片段合理替換從而生成一個全新的虛擬分子,再結合Amber分子動力學進行能量優(yōu)化,并對最后構象進行結合自由能計算 (MM/PBSA),挑選打分較高的化合物進行后續(xù)研究。該方法的優(yōu)點是可以合理地、高效率地找到高活性化合物。基于該方法,本課題組已經成功設計并合成了第1個活性達到皮摩爾級別的細胞色素bc1復合物Qo位點抑制劑,該部分內容已有文獻做了詳細闡述。隨后進一步把PFVS方法應用到SDH靶標中進行新型抑制劑的設計,最終獲得高活性候選殺菌劑氟苯醚酰胺 (詳見下文分析),同時也進一步說明了PFVS方法的普適性較高。

2 氟苯醚酰胺的創(chuàng)制經緯

2.1 現有商品化 SDHI 作用機制研究

藥物分子的作用機制是新型藥物分子設計的基石。為此,我們選擇10個商品化SDHI (圖式2),測試了它們對豬心來源的SDH酶水平的生物活性,與此同時,采用分子對接和結合自由能評價方法研究了其結合模式。結果如表1所示,∆Gexp(∆G = −RTlnKi) 與∆Gcal 之間的相關性r2達到0.94,表明結合模式的正確性。

如圖2所示,該類化合物中酸部分結構嵌入活性腔中,與C_R46形成陽離子-π相互作用,酰胺鍵的羰基氧原子與B_W173和D_Y91形成氫鍵,其胺部分伸向活性腔口處,與C_W35、C_I43、C_I30 形成疏水相互作用。 

2.2 二苯醚片段的發(fā)現 

基于上述作用機制,固定吡噻菌胺結構中吡唑酰胺部分,采用PFVS方法對其胺部分進行碎片篩選,獲得了8個打分靠前的hit苗頭化合物 (圖式3)。生物活性測試結果顯示,hit4在10μmol/L 濃度下對豬心SCR (SDH 和復合物III 的混合物) 的 IC50值為19.79μmol/L,顯示出進一步優(yōu)化的價值。

2.3 二苯醚片段上取代基的優(yōu)化

分子模擬結果顯示,化合物hit4與靶標的作用方式與商品化SDHI 類似 (圖3A),其羰基的氧原子與D_Y91、B_W173 形成氫鍵相互作用。值得關注的是,相對于已有商品化SDHI的胺部分化學結構 (圖式2),hit4中二苯醚片段的柔性較大,末端苯環(huán)能夠與C_W35 形成 π-π 相互作用。因此擬通過對hit4中末端苯環(huán)進行取代基衍生,以期進一步提高該類化合物的生物活性。 

如圖4所示,先對二苯醚末端苯環(huán)進行修飾獲得末端苯環(huán)的優(yōu)勢取代基,隨后固定末端苯環(huán)的優(yōu)勢取代基對吡唑環(huán)進行修飾最終獲得高活性化合物?；衔锏臉嬓шP系研究結果 (表2) 表明：當化合物末端苯環(huán)2號位上引入單取代基時,其對豬心 SDH的抑制率有著明顯的提高,如化合物2(R2=2-Cl),其IC50值達到了 1.98μmol/L,比先導化合物hit4提高了近10 倍；而3號位引入取代基則不利于 SDH抑制活性的提高,如化合物3(R2=3-Cl,IC50=36.9μmol/L)；4號位的構效關系比較復雜,如引入氟原子 (R2=4-F,4) 或者強吸電子基如氰基 (R2=4-CN,6) 時,其SDH抑制活性急劇下降,但是引入氯原子 (R2=4-Cl,5) 時,其IC50值達4.90μmol/L。當末端苯環(huán)引入雙取代基時,2、4位的修飾對活性的貢獻是最顯著的,如化合物7(R2=2,4-Cl2),其對SDH的IC50值為2.70μmol/L；而化合物8 (R2=2-Cl-4-CF3) 對SDH的IC50值達0.28μmol/L,是hit4的70倍。 

前期研究工作表明,將吡唑環(huán)上的三氟甲基替換為二氟甲基有利于化合物活性的提高。因此,在保留前期所得的優(yōu)勢取代基 (R2=2-Cl-4-CF3等) 的基礎上,進一步設計并合成了一系列二氟甲基取代的化合物,并對其進行了生物活性評價,結果 (表2) 和預期一致,即與相應的三氟甲基取代的化合物相比,二氟甲基取代的系列化合物的活性都有了明顯提高,大部分化合物對豬心來源的SDH的抑制率要更優(yōu)于三氟甲基取代的化合物。隨后對其進行了活體殺菌活性評價,結果(表3) 表明：這一系列化合物對水稻紋枯病和黃瓜白粉病表現出了優(yōu)異的防治效果,其中化合物11在12.5mg/L 下對水稻紋枯病仍然保持了95% 的防效,對黃瓜白粉病有 67%的防效,優(yōu)于對照藥劑噻呋酰胺 (水稻紋枯病61%,黃瓜白粉病0%),具有進一步開發(fā)的價值。

3 田間藥效試驗和殺菌譜測試研究

為了進一步研究化合物11對水稻紋枯病的防治效果,委托國家南方農藥創(chuàng)制中心浙江基地分別在浙江紹興市和寧波市兩地對其進行水稻紋枯病的田間藥效試驗。結果如表4所示：5%的化合物11乳油對水稻紋枯病具有較好的防治效果。以浙江寧波為例,按有效成分75.0g/hm2處理,兩次施藥,第1次與第2次施藥間隔期為13d。第2次施藥后7d和21d防治效果分別達到了69.6% 和81.2%,優(yōu)于對照藥劑 24% 的噻呋酰胺懸浮劑同劑量處理 (2次施藥后7d、21d防治效果分別為48.4%和 75.4%)。同時,在水稻紋枯病初發(fā)期施藥2次,化合物11的防效持效期能夠維持 21d以上,而對照藥劑的防效比5%的化合物11乳油有所下降；浙江紹興的田間藥效試驗表明,按有效成分75.0g/hm2 處理,5%的化合物11乳油的防效與對照藥劑相當。表明化合物11具有良好的市場應用前景。

隨后,對化合物11又進行了殺菌譜測試,如圖5 所示,化合物11可以用于防治小麥上的眾多病害,如小麥白粉病、小麥條銹病、小麥葉銹病、小麥紋枯病、小麥赤霉病、小麥葉枯病等,同時還可以用于防治其他農作物上病害,如油菜菌核病、大豆銹病、花生白絹病、甜瓜白粉病、玉米銹病等。

與此同時,葉片傳導試驗表明,化合物11還具有良好的向上和向下傳導性。需要特別提出的是,從其合成路線 (圖式4) 可以看出,合成化合物11的關鍵中間體為二氟甲基取代的吡唑酰氯和二苯醚,合成成本相對較低,有望在今后農藥市場中大放異彩。 

4 化合物11的作用機制研究

生物活性測試結果表明,化合物11對水稻紋枯病和黃瓜白粉病的防治效果優(yōu)于對照藥劑噻呋酰胺 (表3和表4),為了合理解釋此現象,我們首先采用同源模建和膜動力學方法獲得水稻紋枯病菌 (致病菌為立枯絲核菌R. solani) SDH 的穩(wěn)定三維結構,隨后結合分子對接技術和結合自由計算方法研究了化合物11與不同物種來源的 SDH 作用機制的差異性。分子模擬結果顯示,針對不同物種來源的SDH,結合模式的相同點為：化合物11的羰基氧原子與D_Y91和B_W173形成氫鍵,與 C_R46 形成陽離子-π 作用 (圖3B和圖3D)。值得關注的是,相對于對照藥劑噻呋酰胺 (圖3F) 來說,化合物11結構中二苯醚片段的柔性較大,當與水稻紋枯病 SDH 結合時,其二苯醚片段翻轉了近180°,從而和D_Y91形成π-π 相互作用,使得其與靶標的作用力增強,提高其生物活性。 

5 結語與展望

通過對10個商品化SDHI類殺菌劑的作用機制進行研究,確定了其結合模式,在此基礎上利用 PFVS 方法進行虛擬篩選,得到了8個hit化合物。綜合合成難易程度、可修飾性和對SDH抑制率的高低,優(yōu)先選擇了hit4苗頭作為先導化合物進行優(yōu)化。基于作用機制以及前期工作,對吡唑環(huán)和二苯醚末端苯環(huán)進行取代優(yōu)化,得到了在酶水平和活體水平上均優(yōu)于商品化對照藥劑噻呋酰胺和吡噻菌胺的化合物11。該創(chuàng)制過程進一步證明了PFVS的廣譜性以及該方法在農藥創(chuàng)制過程中具有廣泛的應用前景。運用該方法,成功獲得了具有自主知識產權的新型 SDHI 殺菌劑--氟苯醚酰胺。目前,關于氟苯醚酰胺的抗性風險評估和相關毒理學數據還不夠完善,未來將繼續(xù)補充試驗數據以加速其商品化進程。最后,隨著我國對新農藥創(chuàng)制投入力度的加大,相信未來將有越來越多的具有自主知識產權的優(yōu)秀的產品在農藥市場占據一席之地。