作者：曾令強(qiáng)、羅睿童、陳瓊、郝格非、朱曉磊、楊光富

琥珀酸脫氫酶 (succinate dehydrogenase, SDH)又稱為琥珀酸泛醌氧化還原酶 (succinate ubiquinoneoxidoreductase, SQR),其作為一類重要的殺菌劑靶標(biāo)在農(nóng)藥研究領(lǐng)域扮演著十分重要的角色。琥珀酸脫氫酶抑制劑 (succinate dehydrogenase inhibitor,SDHI) 具有高效、廣譜和環(huán)境友好等特點(diǎn)。自20世紀(jì)60年代第1個(gè)商品化SDHI 萎銹靈上市以來,歷經(jīng)60 余年的發(fā)展,目前已有24個(gè)SDHI 商品化。然而,根據(jù)殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì) (Fungicides Resistance Action Committee, FRAC)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,已有20多種植物病原菌對(duì)SDHI 類殺菌劑表現(xiàn)出抗性,其中16種為田間報(bào)道的抗性,而且植物病原菌對(duì)現(xiàn)有商品化SDHI 的抗性水平已達(dá)到中等甚至高水平抗性。另外,市場(chǎng)上主流的SDHI多為吡唑聯(lián)苯類,該類化合物由于聯(lián)苯片段的存在使得其合成成本相對(duì)較高,且部分SDHI類殺菌劑對(duì)防治植物病害的活性不高,如異丙噻菌胺 雖然對(duì)子囊菌等引起的病害具有優(yōu)異的防治效果,但是對(duì)半知菌以及卵菌活性不佳。因此,發(fā)現(xiàn)合成成本較低且殺菌譜廣的新型SDHI顯得尤為重要。

華中師范大學(xué)楊光富課題組開發(fā)出了″藥效團(tuán)連接碎片虛擬篩選″(pharmacophore-linked frag-ment virtual screening, PFVS) 方法,隨后基于此方法成功創(chuàng)制出了新型 SDHI 殺菌劑-氟苯醚酰胺,試驗(yàn)代號(hào)：Y13149 (本文中化合物 11,圖式 1),中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?201310502473.7,國(guó)際 PCT/CN2013/089220。生物活性測(cè)試結(jié)果表明,氟苯醚酰胺對(duì)水稻紋枯病和黃瓜白粉病具有卓越的防治效果,同時(shí)對(duì)小麥白粉病等病菌具有良好的抑制作用。目前該化合物已經(jīng)轉(zhuǎn)讓給企業(yè)進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)?；诖?本文將從PFVS的角度出發(fā),對(duì)氟苯醚酰胺的創(chuàng)制過程予以介紹,重點(diǎn)分析其創(chuàng)制過程中的研究思路,以期給農(nóng)藥研究人員創(chuàng)制新農(nóng)藥以啟發(fā)。

1 藥效團(tuán)連接碎片虛擬篩選

PFVS (圖1) 是一種基于分子碎片的藥物分子設(shè)計(jì)方法,該方法克服了傳統(tǒng)藥物設(shè)計(jì)方法中必須依賴生物物理技術(shù)進(jìn)行碎片篩選及需要大量高純蛋白的不足,成功實(shí)現(xiàn)了分子碎片的高通量虛擬篩選,使得基于碎片的藥物設(shè)計(jì)方法成為一種更通用的分子設(shè)計(jì)方法。基于抑制劑與靶標(biāo)之間的作用機(jī)制,PFVS方法的核心思想是在保留抑制劑關(guān)鍵藥效團(tuán)的前提下,對(duì)其他部分進(jìn)行片段合理替換從而生成一個(gè)全新的虛擬分子,再結(jié)合Amber分子動(dòng)力學(xué)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化,并對(duì)最后構(gòu)象進(jìn)行結(jié)合自由能計(jì)算 (MM/PBSA),挑選打分較高的化合物進(jìn)行后續(xù)研究。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以合理地、高效率地找到高活性化合物。基于該方法,本課題組已經(jīng)成功設(shè)計(jì)并合成了第1個(gè)活性達(dá)到皮摩爾級(jí)別的細(xì)胞色素bc1復(fù)合物Qo位點(diǎn)抑制劑,該部分內(nèi)容已有文獻(xiàn)做了詳細(xì)闡述。隨后進(jìn)一步把PFVS方法應(yīng)用到SDH靶標(biāo)中進(jìn)行新型抑制劑的設(shè)計(jì),最終獲得高活性候選殺菌劑氟苯醚酰胺 (詳見下文分析),同時(shí)也進(jìn)一步說明了PFVS方法的普適性較高。

2 氟苯醚酰胺的創(chuàng)制經(jīng)緯

2.1 現(xiàn)有商品化 SDHI 作用機(jī)制研究

藥物分子的作用機(jī)制是新型藥物分子設(shè)計(jì)的基石。為此,我們選擇10個(gè)商品化SDHI (圖式2),測(cè)試了它們對(duì)豬心來源的SDH酶水平的生物活性,與此同時(shí),采用分子對(duì)接和結(jié)合自由能評(píng)價(jià)方法研究了其結(jié)合模式。結(jié)果如表1所示,∆Gexp(∆G = −RTlnKi) 與∆Gcal 之間的相關(guān)性r2達(dá)到0.94,表明結(jié)合模式的正確性。

如圖2所示,該類化合物中酸部分結(jié)構(gòu)嵌入活性腔中,與C_R46形成陽離子-π相互作用,酰胺鍵的羰基氧原子與B_W173和D_Y91形成氫鍵,其胺部分伸向活性腔口處,與C_W35、C_I43、C_I30 形成疏水相互作用。 

2.2 二苯醚片段的發(fā)現(xiàn) 

基于上述作用機(jī)制,固定吡噻菌胺結(jié)構(gòu)中吡唑酰胺部分,采用PFVS方法對(duì)其胺部分進(jìn)行碎片篩選,獲得了8個(gè)打分靠前的hit苗頭化合物 (圖式3)。生物活性測(cè)試結(jié)果顯示,hit4在10μmol/L 濃度下對(duì)豬心SCR (SDH 和復(fù)合物III 的混合物) 的 IC50值為19.79μmol/L,顯示出進(jìn)一步優(yōu)化的價(jià)值。

2.3 二苯醚片段上取代基的優(yōu)化

分子模擬結(jié)果顯示,化合物hit4與靶標(biāo)的作用方式與商品化SDHI 類似 (圖3A),其羰基的氧原子與D_Y91、B_W173 形成氫鍵相互作用。值得關(guān)注的是,相對(duì)于已有商品化SDHI的胺部分化學(xué)結(jié)構(gòu) (圖式2),hit4中二苯醚片段的柔性較大,末端苯環(huán)能夠與C_W35 形成 π-π 相互作用。因此擬通過對(duì)hit4中末端苯環(huán)進(jìn)行取代基衍生,以期進(jìn)一步提高該類化合物的生物活性。 

如圖4所示,先對(duì)二苯醚末端苯環(huán)進(jìn)行修飾獲得末端苯環(huán)的優(yōu)勢(shì)取代基,隨后固定末端苯環(huán)的優(yōu)勢(shì)取代基對(duì)吡唑環(huán)進(jìn)行修飾最終獲得高活性化合物。化合物的構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果 (表2) 表明：當(dāng)化合物末端苯環(huán)2號(hào)位上引入單取代基時(shí),其對(duì)豬心 SDH的抑制率有著明顯的提高,如化合物2(R2=2-Cl),其IC50值達(dá)到了 1.98μmol/L,比先導(dǎo)化合物hit4提高了近10 倍；而3號(hào)位引入取代基則不利于 SDH抑制活性的提高,如化合物3(R2=3-Cl,IC50=36.9μmol/L)；4號(hào)位的構(gòu)效關(guān)系比較復(fù)雜,如引入氟原子 (R2=4-F,4) 或者強(qiáng)吸電子基如氰基 (R2=4-CN,6) 時(shí),其SDH抑制活性急劇下降,但是引入氯原子 (R2=4-Cl,5) 時(shí),其IC50值達(dá)4.90μmol/L。當(dāng)末端苯環(huán)引入雙取代基時(shí),2、4位的修飾對(duì)活性的貢獻(xiàn)是最顯著的,如化合物7(R2=2,4-Cl2),其對(duì)SDH的IC50值為2.70μmol/L；而化合物8 (R2=2-Cl-4-CF3) 對(duì)SDH的IC50值達(dá)0.28μmol/L,是hit4的70倍。 

前期研究工作表明,將吡唑環(huán)上的三氟甲基替換為二氟甲基有利于化合物活性的提高。因此,在保留前期所得的優(yōu)勢(shì)取代基 (R2=2-Cl-4-CF3等) 的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步設(shè)計(jì)并合成了一系列二氟甲基取代的化合物,并對(duì)其進(jìn)行了生物活性評(píng)價(jià),結(jié)果 (表2) 和預(yù)期一致,即與相應(yīng)的三氟甲基取代的化合物相比,二氟甲基取代的系列化合物的活性都有了明顯提高,大部分化合物對(duì)豬心來源的SDH的抑制率要更優(yōu)于三氟甲基取代的化合物。隨后對(duì)其進(jìn)行了活體殺菌活性評(píng)價(jià),結(jié)果(表3) 表明：這一系列化合物對(duì)水稻紋枯病和黃瓜白粉病表現(xiàn)出了優(yōu)異的防治效果,其中化合物11在12.5mg/L 下對(duì)水稻紋枯病仍然保持了95% 的防效,對(duì)黃瓜白粉病有 67%的防效,優(yōu)于對(duì)照藥劑噻呋酰胺 (水稻紋枯病61%,黃瓜白粉病0%),具有進(jìn)一步開發(fā)的價(jià)值。

3 田間藥效試驗(yàn)和殺菌譜測(cè)試研究

為了進(jìn)一步研究化合物11對(duì)水稻紋枯病的防治效果,委托國(guó)家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心浙江基地分別在浙江紹興市和寧波市兩地對(duì)其進(jìn)行水稻紋枯病的田間藥效試驗(yàn)。結(jié)果如表4所示：5%的化合物11乳油對(duì)水稻紋枯病具有較好的防治效果。以浙江寧波為例,按有效成分75.0g/hm2處理,兩次施藥,第1次與第2次施藥間隔期為13d。第2次施藥后7d和21d防治效果分別達(dá)到了69.6% 和81.2%,優(yōu)于對(duì)照藥劑 24% 的噻呋酰胺懸浮劑同劑量處理 (2次施藥后7d、21d防治效果分別為48.4%和 75.4%)。同時(shí),在水稻紋枯病初發(fā)期施藥2次,化合物11的防效持效期能夠維持 21d以上,而對(duì)照藥劑的防效比5%的化合物11乳油有所下降；浙江紹興的田間藥效試驗(yàn)表明,按有效成分75.0g/hm2 處理,5%的化合物11乳油的防效與對(duì)照藥劑相當(dāng)。表明化合物11具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

隨后,對(duì)化合物11又進(jìn)行了殺菌譜測(cè)試,如圖5 所示,化合物11可以用于防治小麥上的眾多病害,如小麥白粉病、小麥條銹病、小麥葉銹病、小麥紋枯病、小麥赤霉病、小麥葉枯病等,同時(shí)還可以用于防治其他農(nóng)作物上病害,如油菜菌核病、大豆銹病、花生白絹病、甜瓜白粉病、玉米銹病等。

與此同時(shí),葉片傳導(dǎo)試驗(yàn)表明,化合物11還具有良好的向上和向下傳導(dǎo)性。需要特別提出的是,從其合成路線 (圖式4) 可以看出,合成化合物11的關(guān)鍵中間體為二氟甲基取代的吡唑酰氯和二苯醚,合成成本相對(duì)較低,有望在今后農(nóng)藥市場(chǎng)中大放異彩。 

4 化合物11的作用機(jī)制研究

生物活性測(cè)試結(jié)果表明,化合物11對(duì)水稻紋枯病和黃瓜白粉病的防治效果優(yōu)于對(duì)照藥劑噻呋酰胺 (表3和表4),為了合理解釋此現(xiàn)象,我們首先采用同源模建和膜動(dòng)力學(xué)方法獲得水稻紋枯病菌 (致病菌為立枯絲核菌R. solani) SDH 的穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu),隨后結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)和結(jié)合自由計(jì)算方法研究了化合物11與不同物種來源的 SDH 作用機(jī)制的差異性。分子模擬結(jié)果顯示,針對(duì)不同物種來源的SDH,結(jié)合模式的相同點(diǎn)為：化合物11的羰基氧原子與D_Y91和B_W173形成氫鍵,與 C_R46 形成陽離子-π 作用 (圖3B和圖3D)。值得關(guān)注的是,相對(duì)于對(duì)照藥劑噻呋酰胺 (圖3F) 來說,化合物11結(jié)構(gòu)中二苯醚片段的柔性較大,當(dāng)與水稻紋枯病 SDH 結(jié)合時(shí),其二苯醚片段翻轉(zhuǎn)了近180°,從而和D_Y91形成π-π 相互作用,使得其與靶標(biāo)的作用力增強(qiáng),提高其生物活性。 

5 結(jié)語與展望

通過對(duì)10個(gè)商品化SDHI類殺菌劑的作用機(jī)制進(jìn)行研究,確定了其結(jié)合模式,在此基礎(chǔ)上利用 PFVS 方法進(jìn)行虛擬篩選,得到了8個(gè)hit化合物。綜合合成難易程度、可修飾性和對(duì)SDH抑制率的高低,優(yōu)先選擇了hit4苗頭作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行優(yōu)化。基于作用機(jī)制以及前期工作,對(duì)吡唑環(huán)和二苯醚末端苯環(huán)進(jìn)行取代優(yōu)化,得到了在酶水平和活體水平上均優(yōu)于商品化對(duì)照藥劑噻呋酰胺和吡噻菌胺的化合物11。該創(chuàng)制過程進(jìn)一步證明了PFVS的廣譜性以及該方法在農(nóng)藥創(chuàng)制過程中具有廣泛的應(yīng)用前景。運(yùn)用該方法,成功獲得了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型 SDHI 殺菌劑--氟苯醚酰胺。目前,關(guān)于氟苯醚酰胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)還不夠完善,未來將繼續(xù)補(bǔ)充試驗(yàn)數(shù)據(jù)以加速其商品化進(jìn)程。最后,隨著我國(guó)對(duì)新農(nóng)藥創(chuàng)制投入力度的加大,相信未來將有越來越多的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)秀的產(chǎn)品在農(nóng)藥市場(chǎng)占據(jù)一席之地。