歐盟內(nèi)分泌干擾評(píng)估進(jìn)展激進(jìn)：內(nèi)分泌干擾物的識(shí)別是當(dāng)前全球化學(xué)品安全性評(píng)估中關(guān)注的重點(diǎn),尤其是歐盟在2018年針對(duì)農(nóng)藥與消殺產(chǎn)品的內(nèi)分泌干擾物評(píng)審正式啟動(dòng)后,已有多個(gè)活性物質(zhì)(如代森錳鋅等)因?yàn)閮?nèi)分泌干擾效應(yīng)無(wú)法被排除而被歐盟禁用。同時(shí)隨著CLP修正案(Regulation (EC) No 1272/2008)的進(jìn)一步實(shí)施,歐盟也已將內(nèi)分泌干擾物的識(shí)別要求進(jìn)一步拓展到了一般化學(xué)品。

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美國(guó)內(nèi)分泌干擾物識(shí)別進(jìn)展緩慢

雖然美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(US EPA)早在1998年就推動(dòng)基于兩階段的體外和體內(nèi)試驗(yàn)內(nèi)分泌干擾物識(shí)別項(xiàng)目(EDSP),但在實(shí)際法規(guī)應(yīng)用和實(shí)施方面美國(guó)則顯著落后于歐盟。

而EDSP難以推進(jìn)的主要原因在于：花費(fèi)巨大。

據(jù)統(tǒng)計(jì)每個(gè)化學(xué)品僅完成第一階段的試驗(yàn)內(nèi)容預(yù)計(jì)花費(fèi)就高達(dá)百萬(wàn)美元,而其中絕大部分費(fèi)用的支出都集中在體內(nèi)試驗(yàn)項(xiàng)目中。

EDSP兩階段的內(nèi)分泌干擾物識(shí)別試驗(yàn)指南：

(圖片源自：US EPA)

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新途徑技術(shù)方法(NAMs)首次明確可用于內(nèi)分泌干擾物識(shí)別

因此US EPA在十幾年間都聚焦于體外高通量篩選、in silico等新途徑技術(shù)方法(NAMs)的研發(fā),建立了相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)和計(jì)算模型來(lái)嘗試替代之前EDSP第一階段所需要的高昂試驗(yàn)資料。

但為了滿足法規(guī)應(yīng)用目的,這些NAMs能否直接用于第一階段的內(nèi)分泌干擾活性評(píng)估必須得到充分的確認(rèn),US EPA在系統(tǒng)衡量了穩(wěn)健性(strengths)、局限性(limitation)和不確定性(uncertainties)后最終明確了兩種NAMs可以用于替代EDSP第一階段雌激素和雄激素受體信號(hào)通路所需的試驗(yàn)資料。

兩種可用于替代EDSP第一階段試驗(yàn)的NAMs：

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NAMs的成功應(yīng)用依賴于海量數(shù)據(jù)獲取與可靠模型開(kāi)發(fā)

這兩種經(jīng)充分評(píng)估的NAMs成功應(yīng)用均得益于前期由US EPA等機(jī)構(gòu)主導(dǎo)進(jìn)行的ToxCast/Tox21項(xiàng)目,ToxCast/Tox21項(xiàng)目依托于細(xì)胞體外高通量篩選,采用機(jī)械臂進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和靶點(diǎn)檢測(cè),其中涉及內(nèi)分泌干擾相關(guān)靶點(diǎn)的檢測(cè)納入了數(shù)十種細(xì)胞系,并能對(duì)數(shù)千種化合物進(jìn)行高通量檢測(cè),因而此項(xiàng)目的結(jié)果是產(chǎn)生了一個(gè)極大的數(shù)據(jù)集。

Tox21項(xiàng)目中所采用機(jī)械臂進(jìn)行細(xì)胞操作

(來(lái)源：https://tox21.gov/overview/)

為了利用這些數(shù)據(jù)集來(lái)滿足EDSP的替代傳統(tǒng)體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)的需求,ToxCast/Tox21項(xiàng)目又進(jìn)一步向數(shù)據(jù)科學(xué)家開(kāi)放了數(shù)據(jù)集,來(lái)利用這些已產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)具有高預(yù)測(cè)可靠性的模型,由此兩種能滿足法規(guī)評(píng)估要求的內(nèi)分泌干擾NAMs最終被成功開(kāi)發(fā)。

基于網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)體外雌激素受體信號(hào)通路建模分析

(來(lái)源：TOXICOLOGICAL SCIENCES, 148(1), 2015, 137–154)

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證據(jù)權(quán)重(WoE)仍是內(nèi)分泌干擾評(píng)估的關(guān)鍵

本次US EPA除了明確NAMs可以用于內(nèi)分泌干擾物篩選,也在配套發(fā)布的白皮書中再次強(qiáng)調(diào)了需要通過(guò)證據(jù)權(quán)重(WoE)的方式來(lái)整合內(nèi)分泌干擾評(píng)估過(guò)程中涉及的所有相關(guān)數(shù)據(jù),這既包括了已經(jīng)明確的NAMs以及滿足GLP要求的動(dòng)物體內(nèi)數(shù)據(jù),也應(yīng)匯總其他試驗(yàn)結(jié)果(如未經(jīng)明確的NAMs)、(Q)SAR預(yù)測(cè)、藥代/毒代動(dòng)力學(xué)等各種數(shù)據(jù),進(jìn)而毒理學(xué)家能在全面收集和充分評(píng)估的基礎(chǔ)上采用WoE的方式進(jìn)行整合分析,來(lái)得出可靠的內(nèi)分泌干擾物篩選結(jié)果。

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多數(shù)農(nóng)藥品種將受益于NAMs的法規(guī)應(yīng)用

值得注意的是,由于農(nóng)藥的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)一直被廣泛關(guān)注,因此在ToxCast/Tox21以及EDSP等項(xiàng)目立項(xiàng)之初就已涵蓋了多數(shù)農(nóng)藥品種,對(duì)于這些農(nóng)藥可以優(yōu)先考慮采用這兩種NAMs來(lái)滿足法規(guī)登記所需的對(duì)雌激素和雄激素受體信號(hào)通路相關(guān)試驗(yàn)資料,因此將大大降低農(nóng)藥申請(qǐng)人在應(yīng)對(duì)美國(guó)內(nèi)分泌干擾評(píng)估的周期與費(fèi)用。

新途徑技術(shù)方法(New Approach Methods, NAMs)

為應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的轉(zhuǎn)變,美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(US EPA)也提出了一個(gè)新概念：新途徑技術(shù)方法(New Approach Methods, NAMs),該術(shù)語(yǔ)的定義泛指″能夠提供化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估信息,且有別于傳統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),更符合3R原則的測(cè)試技術(shù)方法與它們的組合″。

所以作為一個(gè)符合動(dòng)物福利的新概念,NAMs幾乎囊括了絕大多數(shù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代技術(shù),如虛擬篩選(virtual screening)、(Q)SAR、交叉參照(read-across)、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、器官芯片(Organs-on-a-Chip, OOC)、有害結(jié)局路徑(Adverse Outcome Pathway, AOP)、確定性方法(Defined Approach)、整合測(cè)試與評(píng)估方法(Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA)等。

這些技術(shù)與方法的發(fā)展將實(shí)質(zhì)性地促進(jìn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代。