行業(yè)資訊

基因干擾(RNAi)是一種在動(dòng)物、植物和微生物中高度保守的基因表達(dá)調(diào)控工具。1998年,Fire等首次在秀麗隱桿線蟲中證明了觸發(fā)基因沉默的關(guān)鍵因子是雙鏈RNA(dsRNA),而非單鏈RNA。具體而言,dsRNA被Dicer-like蛋白隨機(jī)剪切成長(zhǎng)度為21～24nt的小RNA(siRNA或 miRNA),siRNA與Argonaute蛋白(AGOs)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISCs),該復(fù)合體與目標(biāo)RNA鏈互補(bǔ),誘導(dǎo)mRNA降解或抑制翻譯進(jìn)程。利用RNAi技術(shù)靶向有害生物的必須基因,實(shí)現(xiàn)高效的基因沉默,可有效控制病蟲害的發(fā)生?；赗NAi技術(shù)創(chuàng)制的新型核酸農(nóng)藥被稱為農(nóng)藥史上第三次革命,與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比,具有靶向性高、易降解、靶點(diǎn)豐富及可靈活設(shè)計(jì)等優(yōu)勢(shì)。

目前,RNAi在植物病蟲害防控領(lǐng)域的應(yīng)用主要通過4種途徑實(shí)現(xiàn)：

(1)HIGS,即培育表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物以防治病蟲害；

(2)VIGS,即利用病毒或微生物表達(dá)和遞送靶標(biāo)生物dsRNA的方法；

(3)SIGS,即創(chuàng)制噴灑型RNA農(nóng)藥,直接噴施于植物表面以控制病原菌和害蟲；

(4)NDGS,即利用納米載體遞送dsRNA以誘導(dǎo)靶標(biāo)基因沉默的方法。

本文介紹了以RNAi為核心的病蟲害防治技術(shù)的研究現(xiàn)狀,分別論述了基于HIGS、VIGS、SIGS和NDGS 策略的RNAi技術(shù)用于防治植物病蟲害的應(yīng)用實(shí)例及商業(yè)化情況,并對(duì)核轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因作物和創(chuàng)制噴灑型RNA農(nóng)藥的瓶頸問題進(jìn)行總結(jié),點(diǎn)明了葉綠體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)和納米載體遞送dsRNA策略的優(yōu)勢(shì)。dsRNA的合成成本、保護(hù)劑和載體制備工藝、轉(zhuǎn)基因植物和載體的生物安全性評(píng)估,仍然是未來在研發(fā)和商業(yè)化生產(chǎn)中需要關(guān)注的問題。

2 利用HIGS策略防控病蟲害

2.1 核轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

研究人員已成功實(shí)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)調(diào)控病蟲害生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因dsRNA,降低靶基因的表達(dá)量,導(dǎo)致靶標(biāo)生物死亡或發(fā)育畸形,從而控制病蟲害發(fā)展的策略。通過核轉(zhuǎn)基因工程向細(xì)胞核導(dǎo)入外源基因的核基因轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種主要的HIGS策略。

2.2 基于核轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因作物的瓶頸

雖然核轉(zhuǎn)基因技術(shù)在防治病蟲害領(lǐng)域取得了顯著成果,但是傳統(tǒng)核轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)的dsRNA會(huì)進(jìn)入植物細(xì)胞質(zhì),被植物自身的Dicer酶識(shí)別和剪切,導(dǎo)致ds RNA無法在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定積累,難以被加工成有效的siRNA,影響了對(duì)靶標(biāo)生物的RNAi效率和防控效果,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲效果不明顯。以葉綠體基因組作為遺傳操作平臺(tái)的葉綠體(質(zhì)體)基因工程技術(shù)克服了核轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的缺陷,拓寬了植物基因工程在防治病蟲害領(lǐng)域的應(yīng)用。 

2.3 葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

植物細(xì)胞中質(zhì)體基因組的拷貝數(shù)可達(dá)1萬,且缺乏RNAi機(jī)制,使得質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為表達(dá) dsRNA的理想工具。近年來,相比于核轉(zhuǎn)基因技術(shù),葉綠體基因工程的優(yōu)勢(shì)逐漸顯現(xiàn),如減少了核轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響；在葉綠體中能穩(wěn)定積累ds RNA以避免進(jìn)入植物自身的RNAi系統(tǒng)等,這使得葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為植物基因工程的一個(gè)新研究熱點(diǎn)。目前,葉綠體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)在防治植物病害方面的研究較少,但有一些基于葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)抗菌蛋白,用于提高植物抗病性的研究。 

3 利用VIGS策略防控病蟲害

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,利用VIGS策略不僅能夠改善農(nóng)藝性狀,還能防治病蟲害,為作物提供保護(hù)。病毒是VIGS策略中的主要載體,由于病毒獨(dú)特的侵染機(jī)制,能有效幫助dsRNA逃脫生物體的物理和生理屏障,在寄主體內(nèi)實(shí)現(xiàn)dsRNA的高效遞送。此外,利用微生物表達(dá)和遞送dsRNA的方法也被歸屬于VIGS策略。例如,采用能產(chǎn)生dsRNA的大腸桿菌喂養(yǎng)昆蟲,不僅可以避免dsRNA被昆蟲消化系統(tǒng)中的酶降解,還能實(shí)現(xiàn)dsRNA的可持續(xù)供應(yīng)。此外,利用共生菌產(chǎn)生害蟲特異性的dsRNA,是一種無創(chuàng)傷遞送dsRNA的方法,適用于多種靶標(biāo)害蟲。當(dāng)靶標(biāo)害蟲攝入共生細(xì)菌后,細(xì)菌能在害蟲體內(nèi)持續(xù)增殖,保障充足的dsRNA,實(shí)現(xiàn)可持續(xù)的基因沉默。 

4 利用SIGS策略防控病蟲害

研究人員對(duì)噴灑型RNA農(nóng)藥防治農(nóng)業(yè)病蟲害進(jìn)行了廣泛的試驗(yàn),證明SIGS是一種具有潛力的非轉(zhuǎn)基因RNAi策略。SIGS策略比HIGS策略在病蟲害防治中具有更廣闊的應(yīng)用前景。例如,噴灑型的RNA農(nóng)藥研發(fā)成本低,周期較短,應(yīng)用場(chǎng)景多且無需面臨嚴(yán)格的市場(chǎng)監(jiān)管和登記審查。當(dāng)dsRNA能夠廉價(jià)、大規(guī)模地生產(chǎn)時(shí),噴灑型RNA農(nóng)藥將是防治病蟲害的理想藥劑。

5 利用NDGS策略防控病蟲害 

5.1 創(chuàng)制噴灑型RNA農(nóng)藥的瓶頸

噴灑型RNA農(nóng)藥在植物表面能直接被昆蟲或病原微生物吸收,誘導(dǎo)有害生物靶標(biāo)基因的沉默。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中,噴灑型RNA農(nóng)藥受諸多環(huán)境因素限制。有研究報(bào)道,直接噴施的dsRNA暴露于空氣中會(huì)被核酸酶和紫外線降解,而在自然環(huán)境中,雨水沖刷和氣流變化會(huì)直接影響植物葉面dsRNA 的積累量,導(dǎo)致無法觸發(fā)有效的RNAi反應(yīng)。昆蟲或病原微生物內(nèi)部的核酸酶和pH環(huán)境都會(huì)影響dsRNA的穩(wěn)定性,嚴(yán)重影響了RNA農(nóng)藥在有害生物體內(nèi)的干擾效率。此外,昆蟲的體壁和微生物的胞壁是阻礙dsRNA攝入的主要物理屏障,降低了噴灑型RNA農(nóng)藥的遞送效率。例如,疫霉吸收dsRNA 的能力非常有限,炭疽菌則不能直接吸收dsRNA,而有益真菌綠色木霉吸收dsRNA的能力較弱。因此,研發(fā)納米載體保護(hù)和遞送dsRNA來克服噴灑型RNA農(nóng)藥應(yīng)用瓶頸已成為前沿?zé)狳c(diǎn)。

5.2 納米載體對(duì)dsRNA的保護(hù)

由于dsRNA被植物吸收不是一個(gè)瞬時(shí)的過程,有延遲效應(yīng),噴灑型RNA農(nóng)藥在田間的應(yīng)用效率與 dsRNA在環(huán)境中的穩(wěn)定性密切相關(guān)。高效的RNAi依賴于充足的dsRNA,但實(shí)際應(yīng)用中諸多因素會(huì)影響 dsRNA在植物表面的積累。基于納米載體的遞送策略能高效保護(hù)dsRNA,提升dsRNA在工作環(huán)境下的穩(wěn)定性。納米載體不僅能增加dsRNA在葉面的滯留量,減少因噴霧飄移而造成的損失,還能保護(hù)dsRNA 免受核酸酶降解和生物體內(nèi)pH微環(huán)境的影響,提高dsRNA在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。有研究報(bào)道以生物黏土作為dsRNA的遞送載體,發(fā)現(xiàn)其能夠減少dsRNA因沖淋而產(chǎn)生的流失,提升了RNAi效率,延長(zhǎng)了植物對(duì)病毒病的抗性周期。在另一項(xiàng)報(bào)道中,陽離子聚合物作為dsRNA的遞送載體,在昆蟲高堿性的腸道環(huán)境中為dsRNA提供了保護(hù),提升了甜菜夜蛾的RNAi效率。 

5.3 納米載體對(duì)dsRNA的遞送

基于納米載體的遞送策略還能有效促進(jìn)dsRNA 在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散、攝取和內(nèi)體逃逸,通過上調(diào)一些與攝取機(jī)制相關(guān)的基因,激活網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,提升dsRNA的遞送效率。在細(xì)胞攝取納米R(shí)NA復(fù)合物后,有些帶胺基的納米載體在細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境中會(huì)出現(xiàn)質(zhì)子化效應(yīng),誘發(fā)溶酶體逃逸,釋放dsRNA或siRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),大幅度提升RNAi的遞送效率。這種納米載體還能穿透植物表皮屏障,將外源dsRNA送入植物體內(nèi),提升了dsRNA進(jìn)入植物細(xì)胞的能力。

6 RNA農(nóng)藥應(yīng)用實(shí)例

6.1 轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)RNAi的應(yīng)用實(shí)例

基于轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)在防治病蟲害領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。在一些包含田間試驗(yàn)的科研型案例中,基于轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)用于防治病蟲害展現(xiàn)出良好的商業(yè)化前景。例如,在田間試驗(yàn)中,轉(zhuǎn)基因棉花的葉片受損面積比正常植株減少了46%～53%,轉(zhuǎn)基因棉花的單鈴重量較正常植株增大了48%,有效減少了綠盲蝽對(duì)棉花產(chǎn)量和質(zhì)量的損害。此外,在防治植物病害的應(yīng)用方面, 由于轉(zhuǎn)基因棉花表達(dá)真菌vdH1基因的dsRNA能夠成功運(yùn)輸?shù)秸婢?xì)胞中,并誘導(dǎo)病菌的基因沉默,阻礙了病原菌微菌核的形成,有效提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)大麗輪枝菌的抗性。拜耳、先正達(dá)等國(guó)際農(nóng)藥公司投入大量的人力和財(cái)力,并掀起了研發(fā)和商品化轉(zhuǎn)基因植物的熱潮。目前,拜耳公司在轉(zhuǎn)基因玉米方面的研發(fā)已取得了顯著成果,并基本投入商業(yè)化生產(chǎn)。

6.2 非轉(zhuǎn)基因形式RNA農(nóng)藥的應(yīng)用實(shí)例

目前,非轉(zhuǎn)基因形式RNA農(nóng)藥在田間的有效性得到了越來越多的驗(yàn)證,但非轉(zhuǎn)基因形式的RNA農(nóng)藥在田間應(yīng)用案例較少,主要的障礙可能是生產(chǎn)dsRNA的成本高昂。ds RNA制劑易應(yīng)用于甲蟲類害蟲。例如,在噴藥初期,dsRNA藥劑對(duì)害蟲的防治效果為32%,不如化學(xué)藥劑的防治效果,但在施藥7d后,dsRNA制劑的防治效果與市售殺蟲劑類似,達(dá)到了84%～95%。在田間噴灑RNA農(nóng)藥防治其他害蟲,如鱗翅目和半翅目害蟲的效果似乎不如甲蟲類,部分原因在于甲蟲類具有較少的降解酶且dsRNA不易被溶酶體消化,因而適合用于RNAi 。2019年,拜耳公司申請(qǐng)了噴灑型dsRNA用于防治蜜蜂狄斯瓦螨的產(chǎn)品登記。2022年,美國(guó)Greenlight Biosciences公司宣布申請(qǐng)登記了一種用于防治馬鈴薯甲蟲的噴灑型dsRNA制劑。在防治植物病害方面,該公司宣布正在積極研發(fā)基于RNAi策略防治白粉病和灰霉病的噴霧型產(chǎn)品,預(yù)計(jì)于2025年獲得批準(zhǔn)上市。硅羿科技有限公司研發(fā)的煙草花葉病毒核酸干擾素目前已經(jīng)完成登記測(cè)試,這種干擾素能夠有效減少病毒病對(duì)煙草或其他茄科植物造成的經(jīng)濟(jì)損失。 

7 展望 

7.1 靶基因的篩選

靶基因篩選是影響RNAi效率的關(guān)鍵因素之一。理想的靶基因應(yīng)該具備高致死和低劑量敏感等特點(diǎn)。若單個(gè)靶基因效果不好,可以2個(gè)或多個(gè)靶基因同時(shí)干擾,從而提升有害生物的死亡率。靶基因的篩選和挖掘是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作,需要更多的研發(fā)投入。

7.2 低成本dsRNA的研發(fā)與工藝優(yōu)化

基于RNAi技術(shù)防治病蟲害的商業(yè)化案例有限,很大程度上受限于dsRNA的研發(fā)成本和復(fù)雜的工藝。目前,無論是在體內(nèi)或體外合成dsRNA,主要是依賴噬菌體的T7序列和RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄獲得特異性序列。在植物基因工程中,培育表達(dá)靶標(biāo)生物dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物耗時(shí)長(zhǎng)、步驟復(fù)雜、效率低且成本高昂。在噴灑型RNA農(nóng)藥的研發(fā)中,如果采用商業(yè)化試劑盒合成所需的dsRNA,步驟雖然相對(duì)簡(jiǎn)單,但試劑成本高昂,生產(chǎn)規(guī)模小,且容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致dsRNA質(zhì)量不佳。大腸桿菌或酵母表達(dá)體系是dsRNA低成本大批量合成的最常用工具。美國(guó)Greenlight Biosciences公司建立了以釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)dsRNA的平臺(tái),通過在酵母中表達(dá)dsRNA用于害蟲治理。該公司還開發(fā)了成本為0.5美元/g的dsRNA 產(chǎn)品用于抗病或殺蟲,適合實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。此外,利用微生物產(chǎn)生特異性的dsRNA以誘導(dǎo)靶標(biāo)生物的RNAi,在防治病蟲害方面具有良好的應(yīng)用前景。由于真菌、病毒或細(xì)菌的修飾相對(duì)容易,且能持續(xù)產(chǎn)生dsRNA,因而在基因遞送和蛋白質(zhì)表達(dá)方面都有應(yīng)用。由于納米材料載體對(duì)RNA制劑的高效保護(hù)和遞送作用,低成本環(huán)保型納米載體的需求無疑會(huì)越來越大。目前,我國(guó)科研界使用較多的星形陽離子聚合物納米載體(SPc)的生產(chǎn)成本約為1.3美元/g,當(dāng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)后,能夠進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。

7.3 基于遞送策略的安全性

目前,基于納米載體、菌液或病毒的遞送策略已被證實(shí)能有效提高ds RNA的遞送效率并為其提供保護(hù)。其中,納米材料作為遞送載體的生物安全性一直備受關(guān)注,即納米材料的降解問題、在環(huán)境中的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)以及對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性。正常田間使用濃度無不良副作用,只有在極高濃度下,雖然不會(huì)影響異色瓢蟲卵的孵化率,但會(huì)降低多種膜蛋白和溶酶體基因的表達(dá)量,損傷昆蟲的腸道組織,導(dǎo)致幼蟲死亡。另外,研究發(fā)現(xiàn),只有極高濃度(1g/L)的SPc才會(huì)對(duì)果蠅的壽命、生育能力、攀爬能力以及抗逆性產(chǎn)生不利的影響,長(zhǎng)期飼喂SPc則會(huì)積累在果蠅腸道組織中,并引起全身性變化。這些工作為評(píng)估納米材料的生物安全性提供了方法和參考。另外,基于微生物系統(tǒng)的遞送平臺(tái)在環(huán)境中傳播也可能會(huì)對(duì)人產(chǎn)生潛在的威脅。 

7.4 基于4種策略的應(yīng)用前景 

7.4.1 HIGS策略

生物技術(shù)的快速發(fā)展使得培育抗蟲或抗病轉(zhuǎn)基因作物的方法越來越豐富,尤其是質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)在防治病蟲害領(lǐng)域的應(yīng)用。有研究報(bào)道,質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過表達(dá)多基因組元件,可同時(shí)賦予轉(zhuǎn)基因植物對(duì)蟲害、病害和非生物脅迫條件的抗性。雖然在一些單子葉植物中,由于缺乏葉片的再生體系,質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)無法利用多次再生培養(yǎng)和篩選來獲得轉(zhuǎn)化植株,但該技術(shù)符合植物基因工程未來的發(fā)展方向,即安全、穩(wěn)定和高效地表達(dá)有害生物的靶標(biāo)基因ds RNA,因而將廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。 

7.4.2 VIGS策略

在農(nóng)業(yè)病蟲害治理方面,以病毒或微生物作為 dsRNA的載體用于觸發(fā)靶標(biāo)生物RNAi的策略具有應(yīng)用潛力。未來,將病毒或微生物作為dsRNA的高效遞送載體,還需要開發(fā)導(dǎo)入產(chǎn)生特異性dsRNA所需模板的有效方法,為大規(guī)模創(chuàng)制施用藥劑奠定基礎(chǔ)。另外,病毒或微生物在田間大規(guī)模施用之前,亟需解決的是在環(huán)境中釋放病毒或微生物所引起的潛在問題。 

7.4.3 SIGS策略

近年來,噴灑型RNA農(nóng)藥在病蟲害防治領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展,具有廣闊的應(yīng)用前景。例如,研發(fā)噴灑型RNA農(nóng)藥所需的時(shí)間比培育轉(zhuǎn)基因植物短,噴灑型RNA農(nóng)藥能夠相對(duì)快速地應(yīng)對(duì)新環(huán)境和新入侵的病蟲害,從而實(shí)現(xiàn)病蟲害的應(yīng)急管理。雖然,噴灑型RNA農(nóng)藥在田間大規(guī)模應(yīng)用之前還需要克服諸多瓶頸限制,但目前已有基于載體或其他保護(hù)劑的遞送系統(tǒng)用于提升dsRNA的穩(wěn)定性和遞送效率,從而實(shí)現(xiàn)噴灑型RNA農(nóng)藥對(duì)病蟲害的高效治理。 

7.4.4 NDGS策略

利用納米載體來保護(hù)和遞送RNA農(nóng)藥快速進(jìn)入植物和害蟲體內(nèi)無疑具備廣闊的發(fā)展前景。此外,可通過研發(fā)多元化的RNA制劑解決RNA農(nóng)藥田間防效不理想的困境。納米載體通過內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)結(jié)合苦參堿,同時(shí)借助外部基團(tuán)的電荷作用及氫鍵作用進(jìn)一步結(jié)合dsRNA,通過RNAi引起桃蚜細(xì)菌性感染,防效可提升至90%,與化學(xué)農(nóng)藥的防效相當(dāng)。這種利用納米載體同時(shí)裝載dsRNA和藥劑的新思路可以治理害蟲的抗藥性、大幅度提升害蟲的防治效果。干擾蚜蟲對(duì)噻蟲嗪應(yīng)急響應(yīng)基因synapsin之后,半數(shù)致死劑量條件下的噻蟲嗪對(duì)蚜蟲的致死率上升至100%,低劑量噻蟲嗪對(duì)蚜蟲的致死率也能達(dá)到90%。未來,還應(yīng)該進(jìn)一步設(shè)計(jì)智能響應(yīng)型納米載體(機(jī)器人),實(shí)現(xiàn)多功能、精準(zhǔn)靶向和可控遞送,不斷提升RNA農(nóng)藥的田間效果,使其接近或達(dá)到化學(xué)農(nóng)藥的防治效果。

作者：關(guān)梅,晁子健,閆碩,沈杰

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