本文通過incoPat科技創(chuàng)新情報平臺(IncoPat收錄了全球102個國家/組織/地區(qū)1億余件專利信息) 進行數據分析,采用關鍵詞及分類號(蝗蟲、螞蚱、locust、locusts、grasshopper、A01N63、C12N、C12R、A01P7/06、A01P7/04、A01P7/02、A01P7/00)對2000年01月01日至2020年10月15日之間的專利數據進行檢索統(tǒng)計。通過全面分析生物方法防治蝗蟲的中國專利申請態(tài)勢、重點申請人狀況和專利技術分析,為生物防治蝗蟲提供專利信息支撐。

1  中國專利申請態(tài)勢

圖1給出了生物防治蝗蟲的申請趨勢?？梢钥闯?生物防治蝗蟲的專利數量并不是很多,發(fā)展也比較晚。2013年以前每年申請的專利數量少于10件,2013年以后申請的數量逐漸增加,但是到2019年每年的申請數量也未能突破30件。申請數量的統(tǒng)計范圍是目前已公開的專利。由于時間原因,部分新申請的專利可能還處于未公開的狀況,導致(圖1)2020年的申請量出現偏低的情況。

圖1  生物防治蝗蟲專利申請趨勢

2  主要申請人的申請量趨勢

由圖2可以看出,國內申請人主要以高校和研究所為主,其中山西大學是生物防治蝗蟲領域申請量最多的申請人,從2000年至今年累計申請量達到42件。排名第二的是中國農業(yè)科學院植物保護研究所,申請量達25件,明顯高于其余申請人。

圖 2  主要申請人的申請量排名

3  國內主要申請人的重點研究方向

3.1  山西大學

由圖3可以看出,山西大學在蝗蟲生物防治研究方面主要著力與RNAi干擾技術的研究。RNA干擾( RNAi)是一種通常由雙鏈RNA分子引起的特異性轉錄后基因沉默現象,這一發(fā)現不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破,同時也為人類的疾病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。山西大學主要研究了通過不同的基因干擾昆蟲幾丁質、昆蟲表皮酯質合成、表皮蛋白等影響抑制蝗蟲蛻皮,達到殺死蝗蟲的效果。

圖3  山西大學防治蝗蟲研究方向

3.2  中國農科院植物保護研究所

圖4顯示中國農科院植保保護研究所在RNAi干擾、真菌防治、通過基因引起免疫抑制反應調節(jié)真菌對蝗蟲侵染的效果等方面都進行了一定的研究。RNAi干擾技術著力研究相關基因干擾蝗蟲的生長發(fā)育,通過干擾蝗蟲的發(fā)育達到防治蝗蟲的目的。真菌防治方面,中國農科院植保研究所主要研究了相關蛋白基因增強綠僵菌殺滅蝗蟲的效率,綠僵菌及金龜子綠僵菌與相關化藥的組合物。中國農科院植保所還通過相關基因導致蝗蟲產生免疫的應答達到致死蝗蟲的效果。

圖4  中國農科院植保所蝗蟲研究方向

3.3  四川大學

申請人發(fā)現一種殺蟲蛋白,該蛋白分子量為25,100 Da。經研究表明,該菌無芽孢,本身具有較強毒蛋白,具有構建成為遺傳工程菌廣泛用于生物防治的潛力。由圖5可知,四川大學在抗殺蟲基因技術上做了相關研究。此外,申請人還對真菌及植物來源的活性化合物對蝗蟲的防治進行了相關研究。

圖5  四川大學蝗蟲防治研究方向

3.4  重慶大學

由圖6可以看出,重慶大學在RNAi干擾技術和真菌防治蝗蟲方面進行了研究。重慶大學研究了ATP合酶α和β亞基基因cDNA 的保守序列,并構建其RNA、DNA等構建體,利用RNAi技術沉默蝗蟲體內ATP合酶α亞基,使體內ATP合酶α亞基的表達明顯受到抑制,導致蝗蟲產生致死效應,可應用于RNAi技術對東亞飛蝗害蟲防治。重慶大學還研究了蝗綠僵菌工程菌株的制備,綠僵菌,以及綠僵菌和化學農藥的組合物進行蝗蟲防治。

圖6  重慶大學蝗蟲防治研究方向

3.5  中國農業(yè)大學

蝗蟲微孢子蟲是一種蝗蟲專性的寄生原生動物,只對蝗蟲等直翅目昆蟲有致病性,對脊椎動物完全無致病性,在田間使用過程受環(huán)境條件的限制較小、生產成低,在防治蝗蟲災害的方面有很強競爭力。由圖 7可以看到中國農業(yè)大學主要研究方向是蝗蟲微孢子在防治蝗蟲方面的應用。

圖7  中國農業(yè)大學蝗蟲防治研究方向

4  生物防治蝗蟲專利技術分析

通過國內主要申請人生物防治蝗蟲的研究方向分析可以看出,我國在蝗蟲生物防治方面主要研究方向集中在以下3個方面：(1)RNA干擾技術；(2)真菌防治；(3)蝗蟲微孢子。

4.1  RNA干擾技術

RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉錄后基因沉默的現象,自2006年獲得諾貝爾獎以來,RNAi技術一直躋身于科技前沿。RNAi不僅是研究基因功能的有力工具,同時在害蟲防治方面也具有極大潛力。通過RNA干擾進行害蟲防治具有如下特點：1)殺蟲具有專一性,對非靶標生物無殺傷作用；2)RNA在自然界極易降解,無殘留；3)對環(huán)境無毒無害,相對安全。因此學者將其稱為第四代殺蟲劑?；赗NA干擾進行害蟲防治的基礎技術是篩選靶標序列獲得具有高致死作用的dsRNA。廣泛用于昆蟲RNAi實驗的基本方法有兩種。一種方法是采用體外合成的dsRNA,然后將其導入昆蟲體內或細胞中,稱為外源性RNAi；另一種方法是用DNA表達載體導入昆蟲體內或細胞中,在體內或細胞中表達時合成dsRNA,稱為內源性RNAi。盡管內源性方法可以在昆蟲生活史的任何時間實現細胞特異性或組織特異性的RNAi,具有遺傳性等優(yōu)點,但由于很多昆蟲還沒有建立成功的轉基因體系,所以這種方法目前還并不適合許多昆蟲的基因功能研究。因此外源性RNAi是目前研究的重點手段。國內申請人研究的方向也主要是通過篩選基因序列合成相關的dsRNA,然后將其導入昆蟲體內或細胞中進行防治蝗蟲研究。

4.2  真菌防治

昆蟲病原真菌是昆蟲病原生物中的最大類群。據野外調查越冬昆蟲發(fā)現,昆蟲疾病中約有60%是由真菌引起的,病原真菌也是最早被系統(tǒng)地利用來控制害蟲的昆蟲病原微生物。

蝗蟲的主要病原真菌,包括綠僵菌 M. anisopliae、白僵菌 B. bassiana、黃綠僵菌 M. flavoviride、黃曲霉菌 Aspergillus flavus 等。我國申請人中國農業(yè)科學院植物保護研究所、重慶大學、四川大學、中科院動物研究所、江西天人生態(tài)股份有限公司等都對綠僵菌、白僵菌進行了相關研究,也有對蛋白或化學農藥與綠僵菌或白僵菌組合來提高相應真菌的殺蟲效果的研究。

白僵菌是一種半知菌類的蟲生真菌,可以侵入6個目15科200多種昆蟲、螨類的蟲體內大量繁殖,同時不斷產生白僵素(大環(huán)脂類毒素)和草酸鈣結晶,這些物質可引起昆蟲中毒,使體液發(fā)現機能發(fā)生變化,打亂新陳代謝以致死亡。金龜子綠僵菌屬于半知菌亞門綠僵菌屬,是一種廣譜的昆蟲病原真菌,可寄生于多種昆蟲體內。綠僵菌具有顯著的殺蟲效果,并且具有不同于現有殺蟲劑的全新的作用機理,主要作用于昆蟲血淋巴免疫系統(tǒng),使之喪失免疫防御功能。白僵菌和綠僵菌制劑對人、畜無毒,對作物安全,無殘留、無污染,但能感染家蠶幼蟲,形成僵蠶病。因此,白僵菌和綠僵菌制劑防治蝗蟲具有較強的優(yōu)勢。

4.3  蝗蟲微孢子

蝗蟲微孢子 Nosema(Paranosema)locustae是一種可以侵染100多種直翅目昆蟲的單細胞真核病原微生物,其在田間的應用范圍非常廣泛?；认x取食了被蝗蟲微孢子污染過的食物后,孢子即在蝗蟲消化道中萌發(fā),暴發(fā)性地突出極絲尖端,穿進寄主細胞和中腸腸壁細胞,到達血腔,進入感受性組織細胞如在脂肪體中開始無性裂殖生殖,將孢子的孢原質釋放出來,開始在寄主的細胞內大量繁殖,消耗蝗蟲體內的能源物質,導致蟲體總脂含量和血淋巴甘油脂含量大幅度下降及血淋巴脂肪酶活力大幅度上升,使蝗蟲出現畸形,發(fā)育期延長,壽命縮短,喪失生殖能力。此外,微孢子還可侵染蝗蟲的唾腺、圍心細胞及神經組織；在其病蟲體內的卵細胞、側輸卵管、中輸卵管中均發(fā)現有微孢子,產卵量下降約50%,孵化率極低,取食量下降,隨著微孢子在寄主體內不斷增殖,使寄主的生理機能等遭到破壞而死亡?；认x微孢子不污染環(huán)境、不殺傷天敵、對人畜安全,不產生對其他生物的二次毒害,有利于保護生物多樣性。中國農業(yè)大學針對蝗蟲微孢子蟲的致病力一般較弱的缺陷,從田間患病的東亞飛蝗中分離篩選得到蝗蟲微孢子蟲(Antonospora locustae),命名為AL2008L-04株系,結果表明,AL2008-01株系具有良好的致病力,提高蝗蟲微孢子蟲的毒力。

5  結語

通過專利數據統(tǒng)計和技術分析可以看出,我國生物防治蝗蟲的研發(fā)主體集中在高校和研究所,研究的重點在使用RNA干擾技術。RNA干擾技術具有殺蟲具有專一性,對非靶標生物無殺傷作用；RNA在自然界極易降解,無殘留；對環(huán)境無毒無害,相對安全等優(yōu)點。其研究的機理是通過選擇合適的基因序列然后在體外合成的dsRNA,將合成的dsRNA 在注入蝗蟲體內。這樣的方法在農業(yè)領域大規(guī)模防治蝗蟲上存在施用困難的缺點。因此,研發(fā)適用大規(guī)模防治蝗蟲的RNA干擾技術是未來發(fā)展的方向。

昆蟲病原真菌,相較于化學殺蟲劑,具有環(huán)境友好、抗逆性強、能大量擴散、選擇性高等優(yōu)點,是廣泛應用的一類生物農藥。然而,目前昆蟲病原真菌作為殺蟲劑仍然存在著致死時間較長的缺點。通過研究真菌致病機理,利用基因工程手段改造真菌,提高真菌殺蟲劑的效果是當前研究的一個重要方向。

蝗蟲微孢子蟲是一種蝗蟲專性的寄生原生動物,只對蝗蟲等直翅目昆蟲有致病性,對脊椎動物完全無致病性,實驗研究證明對蜜蜂也不感染,安全性好,而且該病原物在田間使用過程受環(huán)境條件的限制較小、生產成低,因此在防治蝗蟲災害的方面有很強競爭力?？朔斍盎认x微孢子蟲的致病力一般較弱的缺陷,篩選合適的蝗蟲微孢子蟲提高蝗蟲微孢子蟲的毒力是該領域值得關注的研發(fā)方向。