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基于CRISPR/Cas系統(tǒng)基因組編輯技術可以精準定向創(chuàng)制目標突變,已成為基礎研究和生物育種應用的重要工具,具有重要的理論與實踐意義和價值。目前,玉米等作物CRISPR/Cas基因編輯主要技術途徑是通過穩(wěn)定遺傳轉化把基因編輯活性表達盒整合至受體基因組,再生出植株,鑒定出目標突變,再通過遺傳重組分離獲得轉基因陰性目標突變個體擴繁應用。因此,需先篩選出轉基因陽性植株,獲得標突變之后,為排除持續(xù)基因編輯活性可能存在的影響,還需要再篩選轉基因陰性,整個過程需反復篩選與鑒定轉基因陽性與陰性,工作量大,費用費力。種子是陸生種子植物世代交替過程中最適宜分選的孢子體,研發(fā)植物種子的報告系統(tǒng),通過肉眼觀察即可挑選出轉基因陽性與陰性籽粒,簡化工作流程,實用性強,可顯著提高植物基因編輯工作效率。

JIPB近日在線發(fā)表了中國農科院作物科學研究所謝傳曉研究組題為“Establishment of an efficient seed-fluorescence reporter-assisted CRISPR/Cas9 gene-editing in maize”(https://doi.org/10.1111/jipb.13086)的研究論文。該研究建立了玉米種子熒光報告(seed fluorescence reporter, SFR)輔助的CRISPR/Cas9(SFR/Cas9)系統(tǒng),可簡化單個靶標與多靶標突變體庫創(chuàng)制基因編輯工作流程,大大提高了工作效率。

圖1 玉米種子熒光報告系統(tǒng)輔助CRISPR/Cas9(SFR/Cas9)系統(tǒng)

研究組分別采用胚乳糊粉層特異性啟動子(HvASP)和胚特異性啟動子(ZmESP)驅動紅色熒光蛋白DsRED的特異表達,構建了胚(Em-SFR/Cas9)、胚乳(En-SFR/Cas9)以及兩者混合構庫(Em/En-SFR/Cas9)熒光報告系統(tǒng)輔助CRISPR/Cas9,采用該系統(tǒng)對14個靶標基因開展了CRISPR/Cas9基因編輯應用驗證。分別采用單個Em-SFR/Cas9、單個En-SFR/Cas9與12個Em/En-SFR/Cas9混合載體的進行了農桿菌遺傳轉化,結果表明無論是單靶標基因編輯,還是混合構庫基因編輯,均可通過種子胚乳和胚中熒光特征,準確鑒別轉基因或非轉基因,大幅度提高了工作效率。而且,多靶標混池基因編輯過程中,還可以把籽粒分成En-SFR/Cas9、Em-SFR/Cas9和Em/En-SFR/Cas9三種類型,顯著縮小了靶標基因突變篩選的范圍,進一步提高了效率,還篩選得到13個雙基因標復合突變和4個三基因復合突變。該系統(tǒng)可以擴展應用于其他種子作物,尤其對于轉化效率較低的物種或者大規(guī)模構突變庫等工作具有更大的應用價值。

中國農業(yè)科學院作物科學研究所與安徽農業(yè)大學聯(lián)合培養(yǎng)的博士生閆元元為該論文的第一作者,中國農業(yè)科學院作物科學研究所朱金潔博士、祁顯濤博士與安徽農業(yè)大學程備久教授為共同作者,中國農業(yè)科學院作物科學研究所謝傳曉研究員和劉昌林副研究員為論文共同通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金、國家重點研發(fā)計劃、廣東省重點領域研發(fā)計劃和中國農業(yè)科學院基本科研業(yè)務費資助。