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基于CRISPR/Cas系統(tǒng)基因組編輯技術(shù)可以精準(zhǔn)定向創(chuàng)制目標(biāo)突變,已成為基礎(chǔ)研究和生物育種應(yīng)用的重要工具,具有重要的理論與實(shí)踐意義和價(jià)值。目前,玉米等作物CRISPR/Cas基因編輯主要技術(shù)途徑是通過(guò)穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化把基因編輯活性表達(dá)盒整合至受體基因組,再生出植株,鑒定出目標(biāo)突變,再通過(guò)遺傳重組分離獲得轉(zhuǎn)基因陰性目標(biāo)突變個(gè)體擴(kuò)繁應(yīng)用。因此,需先篩選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株,獲得標(biāo)突變之后,為排除持續(xù)基因編輯活性可能存在的影響,還需要再篩選轉(zhuǎn)基因陰性,整個(gè)過(guò)程需反復(fù)篩選與鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性與陰性,工作量大,費(fèi)用費(fèi)力。種子是陸生種子植物世代交替過(guò)程中最適宜分選的孢子體,研發(fā)植物種子的報(bào)告系統(tǒng),通過(guò)肉眼觀察即可挑選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性與陰性籽粒,簡(jiǎn)化工作流程,實(shí)用性強(qiáng),可顯著提高植物基因編輯工作效率。

JIPB近日在線發(fā)表了中國(guó)農(nóng)科院作物科學(xué)研究所謝傳曉研究組題為“Establishment of an efficient seed-fluorescence reporter-assisted CRISPR/Cas9 gene-editing in maize”(https://doi.org/10.1111/jipb.13086)的研究論文。該研究建立了玉米種子熒光報(bào)告(seed fluorescence reporter, SFR)輔助的CRISPR/Cas9(SFR/Cas9)系統(tǒng),可簡(jiǎn)化單個(gè)靶標(biāo)與多靶標(biāo)突變體庫(kù)創(chuàng)制基因編輯工作流程,大大提高了工作效率。

圖1 玉米種子熒光報(bào)告系統(tǒng)輔助CRISPR/Cas9(SFR/Cas9)系統(tǒng)

研究組分別采用胚乳糊粉層特異性啟動(dòng)子(HvASP)和胚特異性啟動(dòng)子(ZmESP)驅(qū)動(dòng)紅色熒光蛋白DsRED的特異表達(dá),構(gòu)建了胚(Em-SFR/Cas9)、胚乳(En-SFR/Cas9)以及兩者混合構(gòu)庫(kù)(Em/En-SFR/Cas9)熒光報(bào)告系統(tǒng)輔助CRISPR/Cas9,采用該系統(tǒng)對(duì)14個(gè)靶標(biāo)基因開(kāi)展了CRISPR/Cas9基因編輯應(yīng)用驗(yàn)證。分別采用單個(gè)Em-SFR/Cas9、單個(gè)En-SFR/Cas9與12個(gè)Em/En-SFR/Cas9混合載體的進(jìn)行了農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化,結(jié)果表明無(wú)論是單靶標(biāo)基因編輯,還是混合構(gòu)庫(kù)基因編輯,均可通過(guò)種子胚乳和胚中熒光特征,準(zhǔn)確鑒別轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因,大幅度提高了工作效率。而且,多靶標(biāo)混池基因編輯過(guò)程中,還可以把籽粒分成En-SFR/Cas9、Em-SFR/Cas9和Em/En-SFR/Cas9三種類(lèi)型,顯著縮小了靶標(biāo)基因突變篩選的范圍,進(jìn)一步提高了效率,還篩選得到13個(gè)雙基因標(biāo)復(fù)合突變和4個(gè)三基因復(fù)合突變。該系統(tǒng)可以擴(kuò)展應(yīng)用于其他種子作物,尤其對(duì)于轉(zhuǎn)化效率較低的物種或者大規(guī)模構(gòu)突變庫(kù)等工作具有更大的應(yīng)用價(jià)值。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所與安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)的博士生閆元元為該論文的第一作者,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所朱金潔博士、祁顯濤博士與安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)程備久教授為共同作者,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所謝傳曉研究員和劉昌林副研究員為論文共同通訊作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助。